Un test de micromodélisme pour mesurer la chiralité cellulaire
Summary
Nous présentons un protocole pour déterminer la chiralité multicellulaire in vitro, en utilisant la technique du micromodèlement. Ce test permet une quantification automatique des biais gauche-droite de divers types de cellules et peut être utilisé à des fins de dépistage.
Abstract
La chiralité est une propriété cellulaire intrinsèque, qui dépeint l’asymétrie en termes de polarisation le long de l’axe gauche-droite de la cellule. Comme cette propriété unique attire de plus en plus l’attention en raison de ses rôles importants dans le développement et la maladie, une méthode de quantification normalisée pour caractériser la chiralité cellulaire ferait progresser la recherche et les applications potentielles. Dans ce protocole, nous décrivons un test de caractérisation de chiralité multicellulaire qui utilise des réseaux de cellules micromotifs. Les micromotifs cellulaires sont fabriqués sur des lames de verre revêtues de titane / or via l’impression par microcontact. Après avoir ensemencé sur les îlots géométriquement définis (par exemple, en forme d’anneau) enrobés de protéines, les cellules migrent directionnellement et forment un alignement biaisé dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, qui peut être automatiquement analysé et quantifié par un programme MATLAB écrit sur mesure. Nous décrivons ici en détail la fabrication de substrats à micromotifs, l’ensemencement cellulaire, la collecte d’images et l’analyse de données et montrons des résultats représentatifs obtenus à l’aide des cellules NIH / 3T3. Ce protocole a déjà été validé dans de multiples études publiées et constitue un outil efficace et fiable pour étudier la chiralité cellulaire in vitro.
Introduction
L’asymétrie gauche-droite (LR) de la cellule, également connue sous le nom de maniabilité cellulaire ou chiralité, décrit la polarité cellulaire dans l’axe LR et est reconnue comme une propriété biophysique fondamentale et conservée 1,2,3,4,5. La chiralité cellulaire a été observée in vivo et in vitro à plusieurs échelles. Des résultats antérieurs ont révélé un tourbillon chiral du cytosquelette d’actine dans des cellules individuelles ensemencées sur des îlots circulaires6, une migration et un alignement biaisés des cellules dans des limites confinées 7,8,9,10,11 et une boucle asymétrique du tube chauffant de poulet 12.
Au niveau multicellulaire, la chiralité cellulaire peut être déterminée à partir de la migration ou de l’alignement directionnel, de la rotation cellulaire, de la dynamique du cytosquelette et du positionnement des organites cellulaires 7,8,9,10,11,12,13. Nous avons établi un test14 basé sur le micromodèlement pour caractériser efficacement le biais chiral des cellules adhérentes 7,8,9,10. Avec les micromotifs en forme d’anneau confinant géométriquement les amas de cellules, les cellules présentent collectivement une migration directionnelle et un alignement biaisé. Un programme MATLAB a été développé pour détecter et mesurer automatiquement l’alignement des cellules dans les images à contraste de phase de l’anneau. La direction de l’alignement local des cellules est quantifiée avec un angle biaisé, en fonction de son écart par rapport à la direction circonférentielle. Après analyse statistique, le motif en anneau des cellules est désigné soit comme des biais dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (CCW), soit comme des biais dans le sens des aiguilles d’une montre (CW).
Ce test a été utilisé pour caractériser la chiralité de phénotypes cellulaires multiples (tableau 1), et l’asymétrie LR des cellules s’est avérée être spécifique au phénotype 7,11,15. De plus, la perturbation de la dynamique et de la morphologie de l’actine peut entraîner une inversion du biais chiral 7,8, et le stress oxydatif peut également altérer la chiralité cellulaire9. En raison de la simplicité de la procédure et de la robustesse de l’approche 7,8,9,10, ce test de chiralité 2D fournit un outil efficace et fiable pour déterminer et étudier la chiralité multicellulaire in vitro.
Le but de ce protocole est de démontrer l’utilisation de cette méthode pour caractériser la chiralité cellulaire. Ce protocole décrit comment fabriquer des réseaux cellulaires à motifs via la technique d’impression par microcontact et effectuer une analyse de chiralité de manière automatisée à l’aide du programme MATLAB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test de motif en forme d’anneau décrit ici fournit un outil facile à utiliser pour la caractérisation quantitative de la chiralité multicellulaire, capable de produire des résultats très fiables et reproductibles. La génération rapide de microenvironnements définis identiques et l’analyse impartiale permettent un traitement automatisé à haut débit d’échantillons de grande taille. Ce protocole traite de la fabrication des micromotifs annulaires, de la structure cellulaire et de l’analyse automatiqu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 et NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan est un boursier Pew en sciences biomédicales (PEW 00026185), soutenu par les Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang est soutenu par l’American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
