Un test de micromodélisme pour mesurer la chiralité cellulaire

Summary

Nous présentons un protocole pour déterminer la chiralité multicellulaire in vitro, en utilisant la technique du micromodèlement. Ce test permet une quantification automatique des biais gauche-droite de divers types de cellules et peut être utilisé à des fins de dépistage.

Abstract

La chiralité est une propriété cellulaire intrinsèque, qui dépeint l’asymétrie en termes de polarisation le long de l’axe gauche-droite de la cellule. Comme cette propriété unique attire de plus en plus l’attention en raison de ses rôles importants dans le développement et la maladie, une méthode de quantification normalisée pour caractériser la chiralité cellulaire ferait progresser la recherche et les applications potentielles. Dans ce protocole, nous décrivons un test de caractérisation de chiralité multicellulaire qui utilise des réseaux de cellules micromotifs. Les micromotifs cellulaires sont fabriqués sur des lames de verre revêtues de titane / or via l’impression par microcontact. Après avoir ensemencé sur les îlots géométriquement définis (par exemple, en forme d’anneau) enrobés de protéines, les cellules migrent directionnellement et forment un alignement biaisé dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, qui peut être automatiquement analysé et quantifié par un programme MATLAB écrit sur mesure. Nous décrivons ici en détail la fabrication de substrats à micromotifs, l’ensemencement cellulaire, la collecte d’images et l’analyse de données et montrons des résultats représentatifs obtenus à l’aide des cellules NIH / 3T3. Ce protocole a déjà été validé dans de multiples études publiées et constitue un outil efficace et fiable pour étudier la chiralité cellulaire in vitro.

Introduction

L’asymétrie gauche-droite (LR) de la cellule, également connue sous le nom de maniabilité cellulaire ou chiralité, décrit la polarité cellulaire dans l’axe LR et est reconnue comme une propriété biophysique fondamentale et conservée 1,2,3,4,5. La chiralité cellulaire a été observée in vivo et in vitro à plusieurs échelles. Des résultats antérieurs ont révélé un tourbillon chiral du cytosquelette d’actine dans des cellules individuelles ensemencées sur des îlots circulaires

Protocol

1. Fabrication de timbres en polydiméthylsiloxane (PDMS)¹⁶

1. Dessinez un réseau d’anneaux à micro-échelle à l’aide d’un logiciel de CAO, d’un diamètre intérieur de 250 μm et d’un diamètre extérieur de 450 μm. Le modèle utilisé dans ce protocole est un réseau de 10 x 10 avec une distance de 850 μm entre les anneaux.
2. Imprimez un masque transparent du motif à la résolution souhaitée à l’aide du service d’impression de masques d’une société de microfabrication (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Les dimensions fournies de l’anneau ont été prouvées pour fonctionner pour de nombreux types de cellules

Results

Quinze minutes après l’ensemencement des cellules NIH/3T3, l’adhésion des cellules sur le motif de l’anneau a été confirmée visuellement par imagerie à contraste de phase. Après une culture ultérieure de 24 h, les cellules sur les motifs sont devenues confluentes et allongées avec des alignements clairement asymétriques, biaisés dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 2). La migration directionnelle des cellules attachées est enregistrée par imagerie time-lapse, la motilité cellulair.......

Discussion

Le test de motif en forme d’anneau décrit ici fournit un outil facile à utiliser pour la caractérisation quantitative de la chiralité multicellulaire, capable de produire des résultats très fiables et reproductibles. La génération rapide de microenvironnements définis identiques et l’analyse impartiale permettent un traitement automatisé à haut débit d’échantillons de grande taille. Ce protocole traite de la fabrication des micromotifs annulaires, de la structure cellulaire et de l’analyse automatique de l’alignement cel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Éthanol 200 proof	Koptec	DSP-MD-43
Système de microscope BZX	Keyence	BZX-600
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), haute teneur en glucose	Gibco	11965092
Évaporateur à faisceau d’électrons	Temscal	BJD-1800	Revêtement de film or-titane
Sérum fœtal bovin	VWR	89510-186
Fibronectine à partir de plasma bovin	Sigma	F1141-5MG
Lames de microscope en verre	VWR	10024-048
Pince à épiler en verre	Exelta	390BSAPI
Pastilles d’évaporation d’or	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 cellules	ATCC	CRL-1658
OAI aligneur de contact	OAI	200	photolithographie UV
Octadécanéthiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Agitateur orbital	VWR	89032-088
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Produit de recherche international	P32080-100T
Polydiméthylsiloxane Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Silicon	Wafer University Wafer	ID#809
Pyruvate de sodium	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 photoresist	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Granulés d’évaporation de titane	International Advanced Matériaux	TI14
Masque transparent (avec fonctionnalité)	Outputicity.com	N/A	Service d’impression de masque
Trypsine-EDTA (0.25 %)	Thermo fisher scientific	25200-072