Un test di micropatterning per la misurazione della chiralità cellulare
Summary
Presentiamo un protocollo per la determinazione della chiralità multicellulare in vitro, utilizzando la tecnica del micropatterning. Questo test consente la quantificazione automatica dei bias sinistra-destra di vari tipi di cellule e può essere utilizzato a scopo di screening.
Abstract
La chiralità è una proprietà cellulare intrinseca, che raffigura l’asimmetria in termini di polarizzazione lungo l’asse sinistro-destro della cellula. Poiché questa proprietà unica attira sempre più attenzione a causa dei suoi ruoli importanti sia nello sviluppo che nella malattia, un metodo di quantificazione standardizzato per caratterizzare la chiralità cellulare farebbe progredire la ricerca e le potenziali applicazioni. In questo protocollo, descriviamo un test di caratterizzazione della chiralità multicellulare che utilizza array di cellule micropatterned. I micropattern cellulari sono fabbricati su vetrini rivestiti in titanio / oro tramite stampa a microcontatto. Dopo la semina sulle isole geometricamente definite (ad esempio, a forma di anello) rivestite di proteine, le cellule migrano direzionalmente e formano un allineamento distorto verso la direzione in senso orario o antiorario, che può essere automaticamente analizzato e quantificato da un programma MATLAB scritto su misura. Qui descriviamo in dettaglio la fabbricazione di substrati micropatterned, la semina cellulare, la raccolta di immagini e l’analisi dei dati e mostriamo risultati rappresentativi ottenuti utilizzando le celle NIH / 3T3. Questo protocollo è stato precedentemente convalidato in diversi studi pubblicati ed è uno strumento efficiente e affidabile per lo studio della chiralità cellulare in vitro.
Introduction
L’asimmetria sinistra-destra (LR) della cellula, nota anche come manualità cellulare o chiralità, descrive la polarità cellulare nell’asse LR ed è riconosciuta come una proprietà biofisica fondamentale, conservata, 1,2,3,4,5. La chiralità cellulare è stata osservata sia in vivo che in vitro su più scale. Precedenti risultati hanno rivelato il vortice chirale del citoscheletro di actina in singole cellule seminate su isole circolari6, la migrazione distorta e l’allineamento delle cellule entro i confiniconfinati 7,8,9,10,11 e il loop asimmetrico del tubo di calore di pollo12.
A livello multicellulare, la chiralità cellulare può essere determinata dalla migrazione direzionale o dall’allineamento, dalla rotazione cellulare, dalla dinamica citoscheletrica e dal posizionamento degli organelli cellulari 7,8,9,10,11,12,13. Abbiamo stabilito un test14 basato sulla micropatterning per caratterizzare in modo efficiente il bias chirale delle celluleaderenti 7,8,9,10. Con i micropattern a forma di anello che confinano geometricamente i cluster cellulari, le cellule mostrano collettivamente una migrazione direzionale e un allineamento distorto. È stato sviluppato un programma MATLAB per rilevare e misurare automaticamente l’allineamento delle celle nelle immagini a contrasto di fase dell’anello. La direzione dell’allineamento cellulare locale è quantificata con un angolo distorto, a seconda della sua deviazione dalla direzione circonferenziale. A seguito di analisi statistica, il modello ad anello delle celle viene designato come bias in senso antiorario (CCW) o bias in senso orario (CW).
Questo test è stato utilizzato per caratterizzare la chiralità di più fenotipi cellulari (Tabella 1) e l’asimmetria LR delle cellule è risultata essere fenotipo-specifica 7,11,15. Inoltre, l’interruzione della dinamica e della morfologia dell’actina può provocare un’inversione del bias chirale 7,8 e lo stress ossidativo può alterare anche la chiralità cellulare9. A causa della semplicità della procedura e della robustezza dell’approccio 7,8,9,10, questo test di chiralità 2D fornisce uno strumento efficiente e affidabile per determinare e studiare la chiralità multicellulare in vitro.
Lo scopo di questo protocollo è dimostrare l’uso di questo metodo per caratterizzare la chiralità cellulare. Questo protocollo descrive come fabbricare array cellulari modellati tramite la tecnica di stampa a microcontatto e condurre analisi di chiralità in modo automatizzato utilizzando il programma MATLAB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test di patterning a forma di anello qui descritto fornisce uno strumento di facile utilizzo per la caratterizzazione quantitativa della chiralità multicellulare, in grado di produrre risultati altamente affidabili e ripetibili. La rapida generazione di microambienti identici definiti e l’analisi imparziale consentono l’elaborazione automatizzata ad alta produttività di campioni di grandi dimensioni. Questo protocollo discute la fabbricazione dei micropattern ad anello, il pattern cellulare e l’analisi automatica de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan è un Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), supportato dal Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang è supportato dall’American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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