非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝细胞外基质的 3D 成像
Summary
本协议优化了肝脏 原位 灌注/脱细胞和双光子显微镜方法，以建立一个可靠的平台来可视化非酒精性脂肪性肝炎（NASH）期间细胞外基质（ECM）重塑的动力学。
Abstract
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是美国最常见的慢性肝病，影响超过7000万美国人。NASH可进展为纤维化，最终发展为肝硬化，肝硬化是肝细胞癌的重要危险因素。细胞外基质（ECM）提供结构支持，并通过母细胞信号 维持 肝脏稳态。肝纤维化是由动态ECM重塑过程中的不平衡引起的，其特征是结构元素的过度积累和糖胺聚糖的相关变化。NASH的典型纤维化模式称为“鸡丝”，通常由3区窦周/细胞周围纤维化组成，基于Masson的三色染色和Picrosirius Red染色观察到的特征。然而，这些传统的基于薄二维（2D）组织切片的成像技术无法证明详细的三维（3D）ECM结构变化，限制了对肝纤维化动态ECM重塑的理解。
目前的工作优化了一种快速有效的方案，通过去细胞化 对 肝脏中的天然ECM结构进行成像，以应对上述挑战。用食物或快餐喂养小鼠14周。原 位 门静脉灌注后进行脱细胞，并应用双光子显微镜技术对天然ECM的变化进行成像和分析。对正常肝和NASH肝的3D图像进行重构和分析。通过双光子显微镜进行 原位 灌注脱细胞和分析支架，为可视化肝脏动态ECM重塑提供了一个实用可靠的平台。
Introduction
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的肝脏疾病，影响20%-25%的成年人口。25% 的 NAFLD 患者进展为非酒精性脂肪性肝炎 （NASH），此时肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的风险增加1.在接下来的20年里，据估计，NASH将占美国200万与肝脏相关的死亡。由于没有批准的治疗方法，迫切需要破译导致NASH患者肝纤维化的机制并开发靶向治疗3。
细胞外基质（ECM）是一个动态、复杂的微环境，它与细胞进行双向通信以调节组织稳态4。肝脏ECM由蛋白聚糖、胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白等结构元素和其他非结构蛋白（例如嗅觉素和血小板反应素）组成，以提供物理和结构支持4。
肝纤维化是对各种病因的肝损伤（包括NASH3）的慢性伤口愈合反应。它是由动态ECM基质重塑过程中的不平衡引起的，其特征在于受伤肝脏中结构蛋白过多4。纤维化取决于不同肝细胞类型之间的动态细胞间通讯。肝星状细胞（HSC）在激活时分化为平滑肌Alpha 2肌动蛋白表达，迁移和增殖肌成纤维细胞样细胞，并合成ECM蛋白作为伤口闭合作用。活化的造血干细胞是肝脏中产生胶原蛋白的中枢细胞1。
ECM重塑的分子机制，纤维化模式及其与细胞事件的关系尚不清楚。尽管质谱技术有助于分析ECM蛋白组成4，但仍需要更好地了解三维（3D）ECM结构。传统上，马森氏三色染色、Picro 天狼星红染色和二次谐波产生 （SHG） 成像已在二维 （2D） 薄肝切片上进行。NASH的典型纤维化模式称为“鸡丝”，它延伸到3区，是窦周/细胞周围纤维化5，6。然而，缺乏针对天然肝脏3D结构的研究，特别是那些不涉及组织切片的研究。通过肝纤维化动态ECM重塑来识别纤维化的模式和特征的稳健成像方法将显着加强对NASH机制的理解并确定新的治疗靶点。
为了应对这些挑战，优化了一种快速有效的方案，通过脱细胞7对天然肝脏ECM进行成像。全肝脱细胞是一种去除肝细胞内容物的方法，同时通过洗涤剂灌注维持天然 3D ECM 网络。小鼠喂食食物或快餐饮食（FFD）14周。在用温和的洗涤剂和低流速原位门静脉灌注后进行脱细胞，以保留三螺旋和天然原纤维胶原蛋白结构。应用双光子显微镜分析ECM中胶原蛋白结构的变化。对正常肝和NASH肝中天然ECM结构的3D图像进行了重构和分析。通过双光子显微镜进行原位灌注脱细胞和分析支架提供了一个实用且经济实惠的平台来可视化肝脏中的动态ECM重塑。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议表明，通过低流速DOC原位灌注进行脱细胞可保留易碎的三螺旋和天然原纤维胶原结构，为捕获NASH肝纤维化的动态ECM重塑提供了可靠且具有成本效益的平台。尽管在鉴定ECM成分或生成用于细胞培养的生物支架之前，已在正常和纤维化肝脏中进行去细胞化，但ECM重塑在肝纤维化中的动力学尚未得到充分研究8，9，10。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Hyesuk Park的技术帮助。这项研究得到了国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（NIDDK），NIH（R01 2DK083283，到NJT），国家老龄化研究所（NIA），NIH（1R01AG060726，到NJT）的资助。我们非常感谢贝克曼中心细胞科学成像设施的Jon Mulholland和Kitty Lee在双光子显微镜成像方面的技术援助。
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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