비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징
Summary
현재 프로토콜은 비알코올성 지방간염(NASH) 동안 세포외 기질(ECM) 리모델링의 역학을 시각화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축하기 위해 간 상피내 관류/탈세포화 및 이광자 현미경 방법을 최적화합니다.
Abstract
비알코올성 지방간염(NASH)은 미국에서 가장 흔한 만성 간 질환으로 7천만 명 이상의 미국인에게 영향을 미칩니다. NASH는 섬유증으로 진행될 수 있으며 결국 간세포 암종의 중요한 위험 요소인 간경변으로 진행될 수 있습니다. 세포외 기질(ECM)은 구조적 지원을 제공하고 모세포 신호를 통해 간 항상성을 유지합니다. 간 섬유증은 동적 ECM 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 구조 요소의 과도한 축적 및 글리코사미노글리칸의 관련 변화를 특징으로 합니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 “치킨 와이어”라고 불리며, 일반적으로 Masson의 삼색 염색과 Picrosirius Red 염색에 의해 관찰되는 특징을 기반으로 영역 3 perisinusoidal/pericellular 섬유증으로 구성됩니다. 그러나 이러한 기존의 얇은 2차원(2D) 조직 슬라이드 기반 이미징 기술은 상세한 3차원(3D) ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링에 대한 이해를 제한합니다.
현재 작업은 위의 문제를 해결하기 위해 탈세포화를 통해 간의 기본 ECM 구조를 이미지화하는 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다. 쥐에게 14주 동안 차우나 패스트푸드 식단을 먹였습니다. 제자리 문맥 관류 후 탈세포화를 수행하고, 이광자 현미경 기술을 적용하여 천연 ECM의 변화를 이미지화하고 분석했습니다. 정상 간과 NASH 간의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석함으로써 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공했습니다.
Introduction
비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 성인 인구의 20%-25%에 영향을 미치는 가장 흔한 간 질환입니다. NAFLD 환자의 25%는 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행되며, 여기서 간경변, 간부전 및 간세포 암종의 위험이 증가합니다1. 향후 20년 동안 NASH는 미국에서 200만 명의 간 관련 사망을 차지할 것으로 추정됩니다. 승인된 치료법이 없기 때문에 NASH 환자에서 간 섬유증을 유발하는 메커니즘을 해독하고 표적 치료법을 개발하는 것이 시급합니다3.
세포외 기질(ECM)은 조직 항상성을 조절하기 위해 세포와 양방향 통신을 발휘하는 역동적이고 복잡한 미세환경이다4. 간 ECM은 프로테오글리칸, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 기타 비구조적 단백질(예: 올팩토메딘 및 트롬보스폰딘)과 같은 구조적 요소로 구성되어 물리적 및 구조적 지지를 제공한다4.
간 섬유증은 NASH3를 포함한 다양한 병인의 간 손상에 대한 만성 상처 치유 반응입니다. 이는 동적 ECM 매트릭스 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 손상된 간에서 과도한 구조 단백질을 특징으로 합니다4. 섬유 형성은 서로 다른 간 세포 유형 간의 동적 세포-세포 통신에 달려 있습니다. 간 성상 세포(HSC)가 활성화되면 평활근 알파 2 액틴 발현, 이동 및 증식 근섬유아세포 유사 세포로 분화하고 상처 봉합 작용으로 ECM 단백질을 합성합니다. 활성화된 HSC는 간에서 콜라겐을 생성하는 세포의 중심입니다1.
ECM 리모델링의 분자 메커니즘, 섬유증의 패턴 및 세포 사건과의 관계는 명확하지 않습니다. 3차원(3D) ECM 구조에 대한 더 나은 이해는 질량분석법 기술이 ECM 단백질 조성을 분석하는 데 도움이 되었음에도 불구하고 여전히 필요하다4. 전통적으로 Masson의 삼색 염색, Picro Sirius Red 염색 및 SHG(2차 고조파 생성) 이미징은 2차원(2D) 얇은 간 섹션에서 수행되었습니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 “치킨 와이어”라고 불리며, 이는 영역 3까지 확장되며 perisinusoidal/pericellular fibrosis 5,6입니다. 그러나 천연 간의 3D 구조, 특히 조직 절편을 포함하지 않는 연구에 초점을 맞춘 연구가 부족했습니다. 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 전반에 걸쳐 섬유증의 패턴과 특성을 식별하기 위한 강력한 이미징 접근 방식은 NASH 메커니즘에 대한 이해를 크게 강화하고 새로운 치료 표적을 식별할 것입니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 탈세포화(decellularization)를 통해 천연 간 ECM을 이미지화하도록 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다7. 전체 간 탈세포화는 세제 관류를 통해 기본 3D ECM 네트워크를 유지하면서 간 세포 내용물을 제거하는 접근 방식입니다. 마우스는 14주 동안 차우 또는 패스트푸드 식단(FFD)을 먹였습니다. 탈세포화는 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하기 위해 중성 세제와 낮은 유속으로 현장 문맥 관류 후 수행되었습니다. ECM의 콜라겐 구조 변화를 분석하기 위해 이광자 현미경을 적용했습니다. 정상 및 NASH 간에서 기본 ECM 구조의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석하면 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 저유속 DOC in situ 관류를 통한 탈세포화가 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하여 NASH 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링을 캡처하기 위한 안정적이고 비용 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다. ECM 성분을 확인하거나 세포 배양을 위한 생물학적 스캐폴드를 생성하기 전에 정상 및 섬유성 간에서 탈세포화를 수행했지만, 간 섬유증에서 ECM…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술적인 도움을 주신 박혜석 의원님께 감사드립니다. 이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT), 국립 노화 연구소 (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT)의 자금 지원으로 지원되었습니다. 이광자 현미경 이미징에 대한 기술 지원을 제공한 Beckman Center의 Cell Sciences Imaging Facility의 Jon Mulholland와 Kitty Lee에게 감사드립니다.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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