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Article de méthode

Imagerie vivante et quantification de l’infection virale chez des souris transgéniques K18 hACE2 à l’aide du SARS-CoV-2 recombinant exprimant le rapporteur

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DOI :

10.3791/63127

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5 novembre 2021

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1Texas Biomedical Research Institute

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la dynamique des infections virales à l’aide du (r)SARS-CoV-2 recombinant exprimant la luciférase et la fluorescence et d’un système d’imagerie in vivo (IVIS) chez des souris transgéniques K18 hACE2 pour surmonter le besoin d’approches secondaires nécessaires pour étudier les infections par le SRAS-CoV-2 in vivo.

Résumé

La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a été causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). À ce jour, le SRAS-CoV-2 a été responsable de plus de 242 millions d’infections et de plus de 4,9 millions de décès dans le monde. Comme d’autres virus, l’étude du SRAS-CoV-2 nécessite l’utilisation de méthodes expérimentales pour détecter la présence de virus dans les cellules infectées et/ou dans des modèles animaux. Pour surmonter cette limitation, nous avons généré des protéines recombinantes (r)SARS-CoV-2 capables de réplication qui expriment des protéines bioluminescentes (nanoluciférase, Nluc) ou fluorescentes (Vénus). Ces rSARS-CoV-2 exprimant le rapporteur permettent de suivre les infections virales in vitro et in vivo sur la base de l’expression des gènes rapporteurs Nluc et Venus. Ici, l’étude décrit l’utilisation de rSARS-CoV-2 / Nluc et rSARS-CoV-2 / Venus pour détecter et suivre l’infection par le SRAS-CoV-2 dans le modèle murin transgénique de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine K18 (hACE2) précédemment décrit à l’aide de systèmes d’imagerie in vivo (IVIS). Ce rSARS-CoV-2/Nluc et rSARS-CoV-2/Venus montrent une pathogénicité de type rSARS-CoV-2/WT et une réplication virale in vivo. Il est important de noter que Nluc et l’expression de Vénus nous permettent de suivre directement les infections virales in vivo et ex vivo, chez des souris infectées. Ces rSARS-CoV-2/Nluc et rSARS-CoV-2/Venus représentent une excellente option pour étudier la biologie du SARS-CoV-2 in vivo, pour comprendre l’infection virale et la maladie COVID-19 associée, et pour identifier des traitements prophylactiques et/ou thérapeutiques efficaces pour lutter contre l’infection par le SARS-CoV-2.

Introduction

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est un virus à ARN simple brin enveloppé, à sens positif, qui appartient à la lignée des Betacoronavirus de la famille des Coronaviridae 1. Cette famille virale est divisée en Alpha-, Beta-, Gamma-, et Delta-coronavirus1. Les alpha- et betacoronavirus infectent principalement les mammifères, tandis que les Gamma- et Deltacoronavirus infectent presque exclusivement les oiseaux2. À ce jour, sept coronavirus (CoV) ont franchi les barrières des espèces et sont apparus comme des coronavirus humains (HCoV) : deux alpha-CoV (HCoV-229E et HCoV-NL63) et cinq bêta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient [MERS-CoV] et SARS-CoV-2)3,4,5,6. Le SRAS-CoV, le MERS-CoV et le SARS-CoV-2 sont hautement pathogènes et causent une infection grave des voies respiratoires inférieures7. Avant l’émergence du SRAS-CoV-2, il y avait deux épidémies causées par des CoV : le SARS-CoV à Guangdong Providence, en Chine, de 2002 à 2003, avec un taux de létalité d’environ 9,7 %; et merS-CoV au Moyen-Orient de 2012 à aujourd’hui, avec un CFR d’environ 34%7,8. Le SARS-CoV-2 a un CFR global compris entre 3,4% et 49%, les conditions sous-jacentes contribuant à un CFR plus élevéde 8,9. Depuis sa découverte en décembre 2019, à Wuhan, en Chine, le SARS-CoV-2 a été responsable de plus de 242 millions d’infections humaines et de plus de 4,9 millions de décès humains dans le monde 7,10,11,12. Notamment, depuis la fin de 2020, les nouvelles variantes préoccupantes (VoC) et les variantes d’intérêt (VoI) du SRAS-CoV-2 ont eu une incidence sur les caractéristiques du virus, y compris la transmission et l’antigénicité 9,13, et l’orientation générale de la pandémie de COVID-19. Pour le traitement des infections à SARS-CoV-2, il n’existe actuellement qu’un seul États-Unis (États-Unis). L’antiviral thérapeutique (remdésivir) de la Food and Drug Administration (FDA) et un médicament d’autorisation d’utilisation d’urgence (EUA) (baricitinib, à administrer en association avec le remdésivir)14. Il existe également 6 anticorps monoclonaux EUA approuvés: REGEN-COV (casirivimab et imdevimab, administrés ensemble), sotrovimab, tocilizumab et bamlanivimab et étesevimab administrés ensemble 15,16,17,18,19. Il n’existe actuellement qu’un seul vaccin prophylactique approuvé par la FDA, Pfizer-BioNTech, et deux autres vaccins prophylactiques (Moderna et Janssen) ont été approuvéspar l’EUA 20,21,22,23,24. Cependant, avec le taux d’infection incontrôlé et l’émergence de la VoC et de la VoI, le SARS-CoV-2 constitue toujours une menace pour la santé humaine. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires de toute urgence pour identifier des prophylactiques et des traitements efficaces pour contrôler l’infection par le SRAS-CoV-2 et la pandémie de COVID-19 toujours en cours.

L’étude du SARS-CoV-2 nécessite des techniques laborieuses et des approches secondaires pour identifier la présence du virus dans les cellules infectées et/ou des modèles animaux d’infection validés. L’utilisation de la génétique inverse a permis la génération de virus recombinants pour répondre à des questions importantes dans la biologie des infections virales. Par exemple, les techniques de génétique inverse ont fourni des moyens de découvrir et de comprendre les mécanismes de l’infection virale, de la pathogenèse et de la maladie. De même, les approches de génétique inverse ont ouvert la voie à la conception de virus recombinants dépourvus de protéines virales pour comprendre leur contribution à la pathogenèse virale. En outre, des techniques de génétique inverse ont été utilisées pour générer des virus recombinants exprimant des gènes rapporteurs pour des applications in vitro et in vivo, y compris l’identification d’approches prophylactiques et / ou thérapeutiques pour le traitement des infections virales. Les protéines fluorescentes et bioluminescentes sont les gènes rapporteurs les plus couramment utilisés en raison de leur sensibilité, de leur stabilité et de leur facilité de détection basée sur l’amélioration des nouvelles technologies25,26. In vitro, il a été démontré que les protéines fluorescentes constituent une meilleure option pour la localisation des virus dans les cellules infectées, tandis que les luciférases sont plus pratiques pour les études de quantification 27,28,29. In vivo, les luciférases sont préférées aux protéines fluorescentes pour l’imagerie d’animaux entiers, tandis que les protéines fluorescentes sont préférées pour l’identification des cellules infectées ou l’imagerie ex vivo 30,31,32. L’utilisation de virus recombinants exprimant le rapporteur a servi d’outil puissant pour l’étude des virus dans de nombreuses familles, y compris, entre autres, les flavivirus, les entérovirus, les alphavirus, les lentivirus, les arénavirus et les virus de la grippe 28,33,34,35,36.

Pour surmonter le besoin d’approches secondaires pour étudier le SARS-CoV-2 et caractériser l’infection par le SARS-CoV-2 en temps réel in vivo, nous avons généré des protéines recombinantes (r)SARS-CoV-2 capables de réplication qui expriment des protéines bioluminescentes (nanoluciférase, Nluc) ou fluorescentes (Vénus) en utilisant notre génétique inverse basée sur les chromosomes artificiels bactériens (BAC) précédemment décrite, qui sont maintenues en une seule copie chez E. coli afin de minimiser la toxicité des séquences virales lors de sa propagation chez les bactéries37,38. Notamment, rSARS-CoV-2/Nluc et rSARS-CoV-2/Venus ont montré une pathogénicité de type rSARS-CoV-2/WT in vivo. Le niveau élevé d’expression de Vénus à partir de rSARS-CoV-2/Vénus a permis de détecter une infection virale dans les poumons de souris transgéniques K18 hACE2 infectées à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (IVIS)39. Les niveaux d’expression de Vénus étaient bien corrélés avec les titres viraux détectés dans les poumons, démontrant la faisabilité d’utiliser l’expression de Vénus comme substitut valide de l’infection par le SRAS-CoV-2. En utilisant rSARS-CoV-2/Nluc, nous avons pu suivre la dynamique de l’infection virale en temps réel et évaluer longitudinalement l’infection par le SARS-CoV-2 in vivo en utilisant la même approche IVIS chez des souris transgéniques K18 hACE2.

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Protocole

Les protocoles impliquant des souris transgéniques K18 hACE2 ont été approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité (IBC) du Texas Biomedical Research Institute (TBRI) et le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC). Toutes les expériences suivent les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches duCanada 40. L’équipement de protection individuelle (EPI) approprié est requis lorsque vous travaillez avec des souris.

1. Utilisation de souris transgéniques K18 hACE2

  1. Acheter et entretenir des souris femelles B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J âgées de 4 à 6 semaines (souris transgéniques K18 hACE2) dans un établissement de soins pour animaux de niveau de biosécurité (BSL)-2 dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes.
    1. Après leur arrivée aux installations BSL2, laissez les animaux s’acclimater pendant 7 jours et transférez-les à l’installation pour animaux BSL-3 pour les infections et autres procédures expérimentales.
    2. En suivant les protocoles de l’IACUC, placez 4 souris par cage. Pour s’assurer que l’animal est décédé, après une infection de souris par rSARS-CoV-2 et l’imagerie in vivo , euthanasier les animaux avec une dose létale de Fatal-Plus (>100 mg / kg).

2. Biosécurité

NOTE: Dans ce manuscrit, rSARS-CoV-2 est généré à l’aide des systèmes génétiques inverses basés sur bac pour la souche SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, comme décrit précédemment37. Toutes les procédures in vivo impliquant des infections rSARS-CoV-2/Nluc ou rSARS-CoV-2/Venus doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique dans des conditions BSL-3.

  1. Nettoyez l’armoire de biosécurité avec 2% de Wexicide et 70% de désinfectant Ethanol séquentiellement avant et après avoir effectué toutes les procédures expérimentales décrites dans cet article.
  2. Stériliser tout le matériel de dissection (ciseaux, pinces à disséquer, etc.) et l’homogénéisateur avant et après chaque utilisation.
  3. Nettoyez la chambre d’isolement et désinfectez à l’aide de comprimés MB10 avant et après chaque utilisation selon les instructions du fabricant.
  4. Jeter tout le matériel biologique produit au cours des procédures suivant les directives du CIB et de l’IACUC.

3. Caractérisation in vivo du rSARS-CoV-2

  1. Infections de souris
    1. Placez les souris transgéniques K18 hACE2 femelles âgées de 4 à 6 semaines dans des cages marquées, identifiez les souris dans chaque cage à l’aide d’un code de poinçon d’oreille et placez 4 souris par cage. Utilisez un groupe de souris pour le poids corporel et la survie et un autre groupe d’animaux pour le titrage viral et l’imagerie.
    2. Avant l’infection, rasez la poitrine des souris du côté ventral du mamelon pectoral à la région du mamelon inguinal pour faciliter le signal de bioluminescence.
    3. Préparer l’inoculum rSARS-CoV-2 avec 105 unités formant de la plaque (PFU)/souris dans des conditions stériles dans un volume total de 50 μL en utilisant une solution saline tampon phosphate (PBS) stérile 1x.
      REMARQUE: Calculer la quantité de rSARS-CoV-2 à utiliser dans la dilution virale avec la formule: virus nécessaire = (105 PFU par souris / 50 μL) x volume final) / titre viral de stock.
    4. Gardez l’inoculum du virus au frais sur la glace.
    5. Utilisez les souris infectées par des simulacres (1x PBS) et les souris infectées par rSARS-CoV-2/WT comme témoins internes. Placez les souris infectées par des simulacres dans une cage séparée des souris infectées par le rSARS-CoV-2.
    6. Anesthésier les souris en utilisant une sédation gazeuse isoflurane à 5% dans une chambre d’anesthésie et maintenir avec 3% d’isoflurane.
    7. Une fois la réaction posturale et le réflexe de redressement confirmés, placez la souris en position couchée dorsale.
    8. Frottez le cou de la souris entre l’index et le pouce et tenez la queue contre la paume de la main avec le petit doigt pour maintenir l’animal en position dorsale.
    9. Placez l’embout de la pipette contenant 50 μL d’inoculum du virus dans la narine et éjectez lentement la solution. Assurez-vous que l’inoculum du virus est inhalé et qu’il n’y a pas de reflux en observant la goutte d’inoculum disparaître.
  2. Surveillance par bioluminescence de souris transgéniques K18 hACE2 infectées par rSARS-CoV-2/Nluc (Figure 1 et Figure 2)
    REMARQUE : cette expérience suit la représentation schématique et utilise les virus affichés à la figure 1. Un accessoire d’anesthésie à l’isoflurane est nécessaire pour le système d’imagerie in vivo (IVIS). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les instruments et les systèmes requis.
    1. Lancez le logiciel d’imagerie et configurez les paramètres, cliquez sur mode image sur Bioluminescence, ouvrez le filtre et réglez le temps d’exposition sur auto.
    2. Lors de l’initialisation de la machine IVIS, placez les souris dans la chambre d’isolement tout en restant à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Induire des souris avec de l’isoflurane à une concentration de 5%. Une fois que la perte de la réaction posturale et du réflexe de redressement est confirmée, maintenez avec 3% d’isoflurane.
    3. Une fois les souris anesthésiées, retirez-les de la chambre d’isolement et administrez rétro-orbitalement le substrat de luciférase dilué 1:10 dans 1x PBS (volume final 100 μL/souris) avec une aiguille de 25 G.
    4. Après l’administration du substrat de luciférase, replacez les souris dans la chambre d’isolement avec la poitrine tournée vers le haut et la cavité nasale à l’intérieur du cône collecteur pour garder l’animal anesthésié pendant la procédure d’imagerie.
    5. Transférez la chambre d’isolation sur la machine IVIS et, instantanément après avoir fermé la porte de l’imageur IVIS, sélectionnez Acquérir dans le logiciel pour l’initialiser (Figure 2A).
    6. Pour analyser les images de bioluminescence acquises, utilisez l’outil ROI (région d’intérêt) du logiciel pour désigner le signal précis et mesurer le flux (Figure 2B).
    7. Cliquez sur Mesurer et laissez le système commencer à évaluer la bioluminescence des photons afin de fournir l’émission absolue de photons comparable aux mesures de sortie fournies par les différents paramètres.
    8. Imagez les souris 1, 2, 4 et 6 jours après l’infection.
    9. Après l’imagerie, replacez les souris dans la cage.
  3. Analyse de fluorescence chez des souris transgéniques K18 hACE2 infectées par rSARS-CoV-2/Venus (Figure 3 et Figure 4)
    REMARQUE : Cette expérience suit la représentation schématique et rSARS-CoV-2 illustrée à la figure 3. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les instruments et les systèmes requis.
    1. Lancez le logiciel d’imagerie et configurez les paramètres, réglez les filtres d’excitation (500 nm) et d’émission (530 nm), cliquez sur le mode image sur Fluorescence et réglez le temps d’exposition sur auto.
    2. Euthanasier les souris par voie intrapéritonéale en utilisant une dose létale de Fatal-Plus (>100 mg/kg). Après l’euthanasie, désinfectez le site d’incision avec de l’éthanol à 70 %.
    3. À l’aide d’une pince à épiler, tirez la peau, faites une incision du sternum à l’abdomen et coupez l’incision sur les côtés avec des ciseaux. Coupez la veine hépatique pour minimiser la quantité de sang dans les poumons et éviter les signaux de fond élevés pendant l’imagerie.
    4. À l’aide de ciseaux, coupez le sternum et ouvrez la cage thoracique. Ensuite, coupez l’extrémité de la trachée avec des ciseaux et retirez les poumons avec une pince à épiler.
    5. Placer les poumons excisés dans une plaque de 6 puits contenant 2 mL de 1x PBS et rincer pour éliminer l’excès de sang. Minimiser la possibilité de contamination entre les échantillons en désinfectant et en nettoyant les outils chirurgicaux entre les échantillons en utilisant de l’éthanol à 70%.
    6. Après avoir initialisé la machine IVIS, placez les poumons dans un plateau noir et séparez les tissus les uns des autres.
    7. Placez le plateau à l’intérieur de la chambre d’isolement à l’intérieur de l’armoire de biosécurité, puis transférez la chambre d’isolement à l’IVIS. Fermez la porte et cliquez sur Acquérir pour lancer le système d’imagerie (Figure 4A).
    8. Pour analyser la fluorescence, utilisez l’outil ROI et dessinez des ROI autour de chacun des poumons individuels. Mesurez chaque retour sur investissement manuellement, puis utilisez les valeurs moyennes d’efficacité radiante données et soustrayez celles des souris infectées par des simulacres (Figure 4B).
    9. Une fois l’imagerie terminée, placez les tissus sur de la glace pour une analyse le jour même ou dans un cryotube pour la congélation de la glace carbonique afin de les stocker à -80 ° C pour un traitement ultérieur.
  4. Imagerie en champ lumineux pulmonaire et notation pathologique de souris transgéniques K18 hACE2 infectées par rSARS-CoV-2/Nluc (Figure 2A-C) et rSARS-CoV-2/Venus (Figure 4A-C)
    1. Après avoir photographié la bioluminescence de souris infectées par rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT et infectées par des simulacres, retournez les souris dans leurs cages. Procéder à l’euthanasie et à l’imagerie ex vivo en champ lumineux des poumons de souris (figure 2A).
    2. Après avoir photographié la fluorescence ex vivo des poumons de souris infectées, prenez des images en champ lumineux des poumons (Figure 4A).
    3. Analyser les lésions grossières à la surface du poumon à l’aide d’ImageJ (figures 2C et 4C).
    4. Ouvrez l’image pulmonaire à analyser dans ImageJ.
    5. Calculez le rapport pixel/cm, utilisez l’outil Droit et mesurez la longueur réelle de l’image.
    6. Après avoir sélectionné, cliquez sur Analyser > Mesure pour calculer la longueur des pixels pour la longueur.
    7. Cliquez sur Analyse > Définir l’échelle et entrez les nombres calculés à partir de l’étape précédente.
    8. Utilisez l’outil Sélections à main levée et sélectionnez toute la surface du poumon. Cliquez sur Analyser > Mesure pour mesurer la surface pulmonaire totale.
    9. Cliquez sur Modifier > Sélection > Faire l’inverse pour sélectionner le reste de la zone pulmonaire, puis appuyez sur Supprimer ou Revenir en arrière pour supprimer l’arrière-plan.
    10. Supprimez la zone sélectionnée, puis cliquez sur Image > Ajuster > seuil de couleur.
    11. Pour sélectionner la zone de la lésion pathologique, ajustez la luminosité à un minimum (entre 1 et 50) et un maximum (entre 50 et 200), en fonction des niveaux de congestion et d’hémorragies présents.
    12. Une fois les lésions pathologiques sélectionnées, cliquez sur Sélectionner en bas du panneau de couleur du seuil, puis cliquez sur Analyser > Mesure pour mesurer les zones pathologiques.
    13. Calculer le pourcentage de lésions brutes avec la formule: % de l’aire pathologique = (mesure de l’aire pathologique/surface pulmonaire totale) x 100.
  5. Titrages viraux (Figure 2D et Figure 4D)
    1. Lors de l’imagerie, complétez l’euthanasie des souris et recueillez les poumons, le cerveau et la muqueuse nasale.
    2. Placez les poumons, le cerveau et la muqueuse nasale dans des homogénéisateurs de tissus stériles séparés et ajoutez 1 mL de PBS froid 1x.
    3. Homogénéiser les échantillons en centrifugant à 21 500 x g pendant 10 min pour granuler les débris cellulaires. Recueillir et transférer les surnageants dans un nouveau tube stérile et jeter la pastille.
    4. Si des titrages viraux sont effectués le même jour, conservez les surnageants à 4 °C. Alternativement, congeler le surnageant des échantillons homogénéisés à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit évalué plus tard.
    5. L’utilisation des surnageants obtenus à partir des homogénats tissulaires permet de multiplier par 10 les dilutions en série et d’infecter les monocouches confluentes des cellules Vero E6 avec 1 mL de chaque dilution du surnageant (format de plaque à 6 puits, 1,2 × 106 cellules / puits, triplicates).
    6. Laisser le virus adsorber pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
    7. Après adsorption virale, laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS et incuber dans 2 mL de milieux post-infection contenant 1% de gélose dans l’incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant 72 h.
    8. Après l’incubation, inactiver les plaques dans du formol tamponné neutre à 10% pendant 24 h à 4 °C, assurer que toute la plaque est immergée.
    9. Retirez les plaques de BSL3 et lavez les cellules trois fois avec 1 mL de 1x PBS et perméabilisez avec 1 mL de Triton X-100 à 0,5% pendant 10 min à température ambiante (RT).
    10. Bloquer les cellules avec 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 2,5 % dans 1x PBS pendant 1 h à 37 °C, suivie d’une incubation dans 1 mL de 1 μg/mL de l’anticorps monoclonal réactif croisé de la protéine SRAS-CoV (1C7C7), dilué dans 2,5 % de BSA pendant 1 h à 37 °C.
    11. Lavez les cellules trois fois avec 1 mL de 1x PBS et développez les plaques à l’aide du kit ABC et du kit DAB Peroxyidase Substrate selon les instructions du fabricant.
    12. Calculez les titres viraux en PFU/mL.
      REMARQUE: Calculer avec la formule PFU/mL = facteur de dilution x nombre de plaques x (1 mL/volume d’inoculum).
  6. Activité de Nluc dans les tissus de souris transgéniques K18 hACE2 infectées par rSARS-CoV-2/Nluc (Figure 2E)
    1. Quantifier la présence de Nluc dans les homogénats d’organes de souris transgéniques K18 hACE2 infectées par des souris transgéniques K18 hACE2 infectées par rSARS-CoV-2/WT à l’aide d’un test de luciférase en suivant les instructions du fabricant.
  7. Évaluation de la morbidité et de la mortalité (Figure 2F, G et Figure 4E, F)
    1. Infecter par voie intranasale des souris transgéniques K18 hACE2 femelles âgées de 4 à 6 semaines avec 105 PFU de rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, ou simulées infectées comme décrit à la rubrique 3.1.
    2. Surveillez et pesez les souris pendant 12 jours en même temps pour minimiser la variation de poids due à l’ingestion de nourriture. Euthanasiez les souris qui perdent 25% de leur poids corporel initial depuis qu’elles ont atteint un point final humain et notez que ces souris succombent à une infection virale.
    3. Après 12 jours, euthanasez les souris qui survivent à une infection virale et calculez le pourcentage de changement de poids corporel et de survie.

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Résultats

Infection à rSARS-CoV-2/Nluc chez des souris transgéniques K18 hACE2 (figures 1 et 2)
La figure 1A montre une représentation schématique des rSARS-CoV-2/WT (en haut) et rSARS-CoV-2/Nluc (en bas) utilisés pour évaluer les infections in vivo. La figure 1B montre l’organigramme schématique appliqué pour évaluer la dynamique de l’infection rSARS-CoV-2/Nluc chez les souris transgéniques K18 h...

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Discussion

Ce protocole démontre la faisabilité de l’utilisation de ces gènes rapporteurs exprimant le rSARS-CoV-2 pour surveiller les infections virales in vivo. Les deux virus recombinants exprimant le rapporteur constituent un excellent outil pour étudier les infections par le SRAS-CoV-2 in vivo. Les systèmes d’imagerie ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) et in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) décrits représentent une excellente option pour comprendre la dynamique de l’infection par le SRAS-CoV-2, la pathogenè...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de tout conflit d’intérêts commercial, financier et non financier, ou personnel en relation avec le travail décrit.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres de notre institut (Texas Biomedical Research Institute) pour leurs efforts visant à maintenir nos installations pleinement opérationnelles et sûres pendant la pandémie de COVID-19. Nous tenons également à remercier notre Comité institutionnel de biosécurité (CIB) et notre orthographe (IACUC) d’avoir examiné nos protocoles de manière rapide. Nous remercions le Dr Thomas Moran de l’École de médecine Icahn du mont Sinaï d’avoir fourni l’anticorps monoclonal de la protéine nucléocapside (N) 1C7C7 réactif croisé du SRAS-CoV. La recherche sur le SARS-CoV-2 dans le laboratoire de Martinez-Sobrido est actuellement soutenue par les subventions NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 et R43AI165089-01; le Ministère de la Défense (DoD) accorde W81XWH2110095 et W81XWH2110103; le San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; le Texas Biomedical Research Institute Forum; le Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio; la Fondation médicale de San Antonio; et par le Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), un centre d’excellence pour la recherche et la réponse à la grippe financé par le NIAID (CEIRR, contrat n° 75N93021C00014).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 % Triton X-100J.T.BakerX198-07Conserver à température ambiante (RT)
1 % DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10 % Solution de formol, tamponnée neutreSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24 puits Plaque de culture cellulaireGreiner Bio-one662160
Bicarbonate de sodium à 5 %Sigma AldrichS-5761
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsGreiner Bio-one657160
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsGreiner Bio-one655-180
Cellules épithéliales rénales de singe vert d’Afrique (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imagerie
Aura Logiciel d’imagerie 3.2.0Spectral Instruments Imagerie Logiciel d’analyse d’images
Albumine sérique bovine (BSA), 35 %Sigma-AldrichA9647Stocker à 4 ° ; C
Eau de culture cellulaireCorning25-055-CV
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStocker à 4 ° ; C
Machine à gaz d’anesthésieVeterinary Anesthesia Systems, Inc.VAS 2001R
Sérum fœtal bovin (FBS)Seradigm1500-050Se conserve à -20 ° ; C
Souris transgéniques femelles K18-hACE2 âgées de quatre à six semainesThe Jackson Laboratory34860
Graphpad Prism Version 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxter1001936040Store at RT
MARS Data Analysis SoftwareBMG LABTECH
MB10 tabletsQUIP LaboratoriesMBTAB1.5Store at RT
Réactif de dosage de la luciférase Nano-GloPromegaN1110Ce réactif est utilisé pour mesurer l’activité de Nluc. Conserver à -20 ° ; C
Nunc MicroWell 96 puitsMicroplaques ThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96 puits MicroplaquesThermoFisher Scientific269620
Pénicilline/Streptomycine/L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIMagasiner à -20 ° ; C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogénéisateurBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
Homogénéisation des tissus mous CK14 &ndash ; 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
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