הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T
Summary
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.
Abstract
תאים המציגים אנטיגן (נגמ”שים) מציגים שלושה אותות מפעילים לתאי T העוסקים במגע פיזי: 1) אנטיגן, 2) תמחיר / דיכוי ליבה, ו -3) ציטוקינים מסיסים. תאי T משחררים שני סוגים של חלקיקי מפעיל בתגובה להפעלה: שלפוחיות טרנס-סינפטיות (tSVs) וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים, המעבירים שליחים בין-תאיים ומתווכים ציטוטוקסיות, בהתאמה. ישויות אלה מופנמות במהירות על ידי נגמ”שים העוסקים במגע פיזי עם תאי T, מה שהופך את האפיון שלהם להרתיע. מאמר זה מציג את הפרוטוקול כדי לפברק ולהשתמש ב-Belayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים (BSLBs) כחיקויים של תאים מציגי אנטיגן (APC) כדי ללכוד ולנתח חלקיקים טרנס-סינפטיים אלה. כמו כן מתוארים הפרוטוקולים למדידות המוחלטות של צפיפות חלבונים על משטחי תאים, שחזור של BSLBs עם רמות פיזיולוגיות כאלה, ואת הליך ציטומטריית הזרימה למעקב אחר שחרור חלקיקים סינפטיים על ידי תאי T. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ללמוד את ההשפעות של חלבונים בודדים, תערובות ליגנד מורכבות, דטרמיננטים פתוגן virulence, ותרופות על תפוקת האפקט של תאי T, כולל תאי T עוזר, לימפוציטים T ציטוטוקסיים, תאי T רגולטוריים, ותאי T קולטני אנטיגן כימריים מבטאים (CART).
Introduction
הסינפסה החיסונית (IS) היא מבנה מולקולרי מרכזי שנוצר בממשק של תאים העוסקים במגע פיזי המאפשר חילופי מידע מוסדר של juxtracrine. ISs שונים תוארו בספרות, וגוף גדל והולך של ראיות מצביע על כך שרכזות מולקולריות אלה הן תכונה שמורה של רשתות סלולריות. תאי חיסון שונים, כולל תאי B, תאי רוצח טבעיים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ותאי T, מחליפים מידע באמצעות הרכבה של מגעים קצרי מועד1. מחקרים רב-לאומיים מקדמים את ההבנה של תת-קבוצות חדשות של לויקוציטים ותאי סטרומה המניעים רשתות תאיות פתוגניות ומבטאים חלבוני שטח בעלי פונקציות לא ידועות. כמו APCs סינתטיים, BSLBs לאפשר חקירה ישירה של התפקיד התפקודי של חלבונים בודדים בשילוב של הפעלת אותות, כלומר אנטיגנים ו costimulation / corepression, על ידי תאי T ואת שחרור וכתוצאה מכך שחרור של חלקיקים מפעילים המכונה אות ארבע.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים ואת הנקודות הטכניות הקריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש ב- BSLBs כדי לחקות את הרכב פני השטח של APCs מודל. הפרוטוקולים למדידה כמותית של קולטני מערכת החיסון וחלבוני שטח אחרים ב- APCs מוצגים יחד עם הפרוטוקול לשחזור של נגמ”שים סינתטיים המכילים כמויות נמדדות אלה. לאחר מכן, השלבים הנדרשים עבור coculturing תאי T ו- BSLB מוצגים יחד עם הפרוטוקול למדידה הכמותית של העברת חלקיקים טרנס-סינפטית באמצעות cytometry זרימה. למרבה הפלא, BSLBs להקל על לימוד אוכלוסייה שמקורה קרום פלזמה של tSVs המכונה אקטואוזומים סינפטיים (SEs). תאי T-cell antigen מועשרים בקולטן (TCR+) SEs נשפכים בתגובה TCR מפעיל2 ביעילות נתפס על ידי BSLBs3, המייצג קריאה מצוינת כדי להעריך את המאפיינים האגוניסטיים של אנטיגנים ואת הרכב הממברנה מודל. אקסוזומים CD63+ וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים (SMAPs) משתחררים גם הם על ידי תאי T מגורים ונלכדים על ידי BSLBs. הם יכולים לשמש כקריאות נוספות של הפעלה והפרשת גרגיר אקסוציטית וליטית וכתוצאה מכך על ידי תאי T. גיוס שלפוחיות אקסוציאטיות לקוטב האינטראקציה של תא T מקל גם על שחרור כיווני של ציטוקינים, כגון IL-2, IFN-γ ו- IL-10 בתגובה להפעלה 4,5,6,7,8. למרות ציטוקינים שוחררו תאי T ניתן לזהות גם על BSLBs, מחקר ייעודי יותר נמצא כעת בפיתוח כדי לאמת את הניתוח הכמותי של שחרור ציטוקינים בסינפסה החיסונית.
כדי לחקור כיצד הרכבי ממברנה ספציפיים משפיעים על התפוקה הסינפטית של תאי T דורש להגדיר את הצפיפות הפיזיולוגית של רכיב קרום היעד. כימות מבוססי ציטומטריה זרימה של חלבונים על פני התא הם צעד חיוני בפרוטוקול זה ודורשים: 1) שימוש בנוגדנים עם מספר ידוע של פלואורוכרום לנוגדן (F/P), ו -2) חרוזי בנצ’מרק המספקים התייחסות סטנדרטית לאינטרפולציה של מולקולות פלואורוכרום מעוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות נמדדות (MFIs).
תקני אמת מידה אלה מורכבים מחמש אוכלוסיות חרוזים, שכל אחת מהן מכילה מספר גדל והולך של פלואורכומים מסיסים מקבילים (MESFs), המשתרעים על פני הטווח הדינמי של זיהוי פלואורסצנטיות שרירותי. אוכלוסיות סטנדרטיות אלה מניבות פסגות פלואורסצנטיות נפרדות, ומאפשרות המרה של יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ל- MESFs על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה. ה- MESFs המתקבלים משמשים לאחר מכן לצד ערכי F/P נוגדנים כדי לחשב את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל תא (או BSLB בשלבים מאוחרים יותר). היישום של אזורי שטח תא משוערים למספר הממוצע של מולקולות שזוהו ואז מאפשר חישוב של צפיפות פיזיולוגית כמו מולקולות / μm2. פרוטוקול כימות זה יכול להיות מותאם גם למדידת צפיפות החלבון על תאי T ולשיקום הביוכימי של הרכבי הממברנה המתווכים את היווצרות הסינפסות ההומוטיפיות של תאי T (כלומר, סינפסות T-T9). במידת הצורך, ניתן להעריך עוד יותר את הערכיות של כריכת נוגדנים באמצעות מטרות רקומביננטיות המסומנות במספרים ידועים של פלואורוכרומים לכל מולקולה. לאחר מכן, ניתן לחשב את הערכיות המחייבת נוגדנים עבור אותה אוכלוסיית BSLB על ידי השוואת מספר חלבונים פלואורסצנטיים מאוגדים ונוגדני כימות (באמצעות שני פלואורוקרומים כימות שונים ותקני MESF).
השחזור של ממברנות APC דורש הרכבה של bilayers השומנים נתמך (SLBs) על חרוזי סיליקה1. מלאי ליפוזום המכיל מינים שונים של פוספוליפידים ניתן לרתום כדי ליצור מטריצת ליפיד-bilayer רב תכליתית, המאפשרת עיגון של חלבונים רקומביננטיים עם כימיה מחייבת שונה (הכנת ליפוזומים מפורטת ב 10). לאחר הגדרת הצפיפות הפיזיולוגית (או הצפיפות) של הליגנד הרלוונטי “על התאים”, אותו פרוטוקול ציטומטריית זרימה מותאם להערכת ריכוז החלבון הרומביננטי הדרוש לציפוי BSLBs בצפיפות הפיזיולוגית של המטרה. ניתן להשתמש בשתי מערכות עיגון שונות בשילוב או בנפרד.
ראשית, SLB המכיל 12.5 mol% סופי של Ni2 + המכיל פוספוליפידים מספיק כדי לספק כ -10,000 אתרי כריכת התג שלו לכל micron10 מרובע ועובד היטב כדי לקשט BSLBs עם רוב החלבונים הזמינים מסחרית אשר צפיפות פיזיולוגית שלהם אינה עולה על קיבולת טעינה מקסימלית זו. מערכת הטעינה השנייה רותמת פוספוליפידים המכילים ביוטין (כמו מול%) לטעינת ביו-טיניל נגד CD3e Fab (או מונומרים HLA/MHC) באמצעות גשרי סטרפטאבידין. השילוב של שתי שיטות קישוט BSLB אלה מאפשר תפירה גמישה של BSLBs כנגמ”שים סינתטיים. עבור קומפוזיציות משטח APC מורכבות מאוד, ניתן להגדיל את המול% של פוספוליפידים וחלבונים כדי לטעון חלבונים רבים ככל שהשאלה בהישג יד דורשת. לאחר ריכוזי העבודה של חלבונים מול% של פוספוליפידים biotinylated מוגדרים, BSLBs ניתן להרכיב כדי לחקור את הפלט הסינפטי של תאי T עם cytometry זרימה multiparametric.
Protocol
Representative Results
Discussion
BSLBs הם כלים רב-תכליתיים לחקר תפוקת החלקיקים של תאי T מגורה עם ממברנות APC מודל. הגמישות של השיטה מאפשרת שחזור של הרכבי ממברנות מורכבים ורדוקציוניסטיים כדי לחקור את ההשפעות של ליגנדים ואת האותות שלהם על הפרשת tSVs וחלקיקי התקפה סופרמולקולרית ורכיביהם. בדקנו טכנולוגיה זו בתאי T שונים, כולל TH, CTL, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה שלנו ולקהילת מכון קנדי לראומטולוגיה על דיונים מדעיים קונסטרוקטיביים, במיוחד מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה שלנו, ג’ונתן וובר. עבודה זו מומנה על ידי מלגת המחקר הראשית של Wellcome Trust 100262Z/12/Z, המענק המתקדם של ERC (SYNECT AdG 670930), וקרן קנדי למחקר ראומטולוגיה (KTRR) (כל השלושה ל- MLD). PFCD נתמך על ידי EMBO ארוך טווח מלגה (ALTF 1420-2015, בשיתוף עם הנציבות האירופית (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ומארי Sklodowska-Curie פעולות) ומלגת אוקספורד-בריסטול מאיירס סקוויב.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
References
- Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
- Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
- Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
- Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
- Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
- Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
- Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021)
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
- Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
- Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
- Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
- Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).
