Fremstilling av perlestøttede Lipid Bilayers for å studere partikkelutgangen av T-celle immunsynapser
Summary
Her presenterer vi protokollen for trinnvis rekonstituering av syntetiske antigen-presenting celler ved hjelp av Perle-støttede Lipid Bilayers og deres bruk for å forhøre synaptisk utgang fra aktiverte T-celler.
Abstract
Antigen-presenterende celler (APCer) presenterer tre aktiveringssignaler til T-celler engasjert i fysisk kontakt: 1) antigen, 2) costimulation / corepression, og 3) oppløselige cytokiner. T-celler frigjør to typer effektorpartikler som svar på aktivering: henholdsvis transsynaptiske vesyrer (TSVer) og supramolekulære angrepspartikler, som overfører intercellulære budbringere og formidler cytotoksisitet. Disse enhetene blir raskt internalisert av APC-er som er engasjert i fysisk kontakt med T-celler, noe som gjør karakteriseringen skremmende. Dette dokumentet presenterer protokollen for å fremstille og bruke Perlestøttede Lipid Bilayers (BSLD-er) som antigen-presenting celle (APC) mimetics for å fange og analysere disse transsynaptiske partiklene. Også beskrevet er protokollene for absolutte målinger av proteintettheter på celleoverflater, rekonstituering av BSLD-er med slike fysiologiske nivåer, og strømningscytometriprosedyren for sporing av synaptisk partikkelfrigjøring av T-celler. Denne protokollen kan tilpasses for å studere effekten av individuelle proteiner, komplekse ligandblandinger, patogene virulens determinanter og legemidler på effektorutgangen av T-celler, inkludert hjelper T-celler, cytotoksiske T-lymfocytter, regulatoriske T-celler og chimeric antigenreseptor-uttrykkende T-celler (CART).
Introduction
Den immunologiske synapsen (IS) er en pivotal molekylær struktur dannet ved grensesnittet av celler engasjert i fysisk kontakt som letter regulert utveksling av jukstracrininformasjon. Ulike ISer har blitt beskrevet i litteraturen, og en voksende mengde bevis tyder på at disse molekylære knutepunktene er et bevart trekk ved mobilnettverk. Ulike immunceller, inkludert B-celler, naturlige morderceller, dendrittiske celler, makrofager og T-celler, utveksler informasjon via montering av kortvarige kontakter1. Multiomiske studier fremmer forståelsen av nye undergrupper av leukocytter og stromale celler som driver patogene cellulære nettverk og uttrykker overflateproteiner med ukjente funksjoner. Som syntetiske APC-er tillater BSLD-er direkte undersøkelse av enkeltproteinenes funksjonelle rolle i integreringen av aktiveringssignaler, nemlig antigener og kostimulering /kjernetrykk, av T-celler og den resulterende frigjøringen av effektorpartikler referert til som signal fire.
Dette dokumentet beskriver protokollene og kritiske tekniske punkter du bør vurdere når du bruker BSLD-er til å etterligne overflatesammensetningen til modell-APCer. Protokollene for kvantitativ måling av immunreseptorer og andre overflateproteiner på APC-er presenteres sammen med protokollen for rekonstituering av syntetiske APC-er som inneholder disse målte mengdene. Deretter presenteres trinnene som kreves for kokulturerende T-celler og BSLB sammen med protokollen for kvantitativ måling av transsynaptisk partikkeloverføring ved hjelp av strømningscytometri. Mest bemerkelsesverdig er BSLD-er lette å studere en plasmamembran-avledet populasjon av TV-er kalt synaptiske ektosomer (SE). T-celle antigenreseptorberiket (TCR +) SE kastes som svar på TCR-utløser2 og effektivt fanget av BSLBs3, som representerer en utmerket avlesning for å vurdere de agonistiske egenskapene til antigener og den modellerte membransammensetningen. CD63+ eksosomer og supramolekulære angrepspartikler (SMAPer) frigjøres også av stimulerte T-celler og fanges opp av BSLD-er. De kan brukes som ytterligere avlesninger av aktivering og den resulterende eksocytiske og lytiske granulatsekresjonen av T-celler. Mobiliseringen av eksocytiske vesikler til den interagerende polen til T-cellen letter også retningsutløsningen av cytokiner, som IL-2, IFN-γ og IL-10 som svar på aktivering4,5,6,7,8. Selv om T-celle utgitt cytokiner også kan påvises på BSLD-er, er en mer dedikert studie for tiden under utvikling for å validere den kvantitative analysen av cytokinfrigjøring ved immunologisk synapse.
For å forhøre hvordan spesifikke membransammensetninger påvirker T-cellenes synaptiske utgang, må du definere den fysiologiske tettheten til målmembrankomponenten. Strømningscytometribaserte kvantifiseringer av celleoverflateproteiner er et viktig skritt i denne protokollen og krever: 1) bruk av antistoffer med kjent antall fluorokromer per antistoff (F/P) og 2) benchmarkperler som gir en standardreferanse for interpolerende fluorokrommolekyler fra målte gjennomsnittlige fluorescensintensiviteter (MFIer).
Disse referansestandardene består av fem perlepopulasjoner, som hver inneholder et økende antall tilsvarende løselige fluorokromer (MESFer), som spenner over det dynamiske spekteret av vilkårlig fluorescensdeteksjon. Disse standardpopulasjonene gir diskrete fluorescenstopper, noe som letter konverteringen av vilkårlige fluorescensenheter til MESFer ved enkel lineær regresjon. De resulterende MESF-ene brukes deretter sammen med antistoff F/P-verdier for å beregne gjennomsnittlig antall bundne molekyler per celle (eller BSLB i senere trinn). Anvendelsen av estimerte celleoverflateområder til gjennomsnittlig antall påviste molekyler muliggjør deretter beregning av fysiologiske tettheter som molekyler / μm2. Denne kvantifiseringsprotokollen kan også tilpasses måling av proteintettheter på T-celler og den biokjemiske rekonstitueringen av membransammensetninger som formidler dannelsen av homotypiske T-cellesynapser (dvs. T-T synapses9). Om nødvendig kan valensen av antistoffbinding videre estimeres ved å bruke rekombinante mål merket med kjent antall fluorokromer per molekyl. Deretter kan antistoffbindende valens beregnes for samme BSLB-populasjon ved samtidig å sammenligne antall bundne fluorescerende proteiner og kvantifiseringsantistoffer (ved hjelp av to forskjellige kvantifiseringsfluorikromer og MESF-standarder).
Rekonstituering av APC membraner krever montering av støttede lipid bilayers (SLD) på silikaperler1. Liposomebestander som inneholder forskjellige fosfolipidarter kan utnyttes til å danne en allsidig lipid-bilayermatrise, noe som muliggjør forankring av rekombinante proteiner med forskjellig bindende kjemi (fremstillingen av liposomer er detaljert i 10). Når den fysiologiske tettheten (eller tettheten) til den aktuelle liganden “på celler” er definert, er den samme strømningscytometriprotokollen tilpasset for å estimere konsentrasjonen av rekombinant protein som trengs for å belegge BSLD-er med målfysiologisk tetthet. To forskjellige forankringssystemer kan brukes enten i kombinasjon eller separat.
For det første er SLB som inneholder en endelig 12,5 mol% av Ni2 +-inneholdende fosfolipider tilstrekkelig til å gi omtrent 10.000 His-tag bindingssteder per kvadrat micron10 og fungerer godt for å dekorere BSLD-er med de fleste kommersielt tilgjengelige proteiner hvis fysiologiske tettheter ikke overstiger denne maksimale lastekapasiteten. Det andre lastesystemet utnytter biotinholdige fosfolipider (som mol%) for å laste biotinylerte anti-CD3e Fab (eller HLA / MHC monomerer) via streptavidinbroer. Kombinasjonen av disse to BSLB dekorasjonsmetodene muliggjør deretter fleksibel skreddersøm av BSLD-er som syntetiske APC-er. For svært komplekse APC-overflatesammensetninger kan mol% av fosfolipider og proteiner økes for å laste så mange proteiner som spørsmålet krever. Når arbeidskonsentrasjonene av proteiner og mol% av biotinylerte fosfolipider er definert, kan BSLD-er monteres for å forhøre den synaptiske utgangen av T-celler med multiparametrisk strømningcytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
BSLD-er er allsidige verktøy for å studere partikkelutgangen til T-celler stimulert med modell APC-membraner. Fleksibiliteten til metoden gjør det mulig for rekonstituering av komplekse og reduksjonistiske membransammensetninger å studere effekten av ligander og deres signaler på sekresjon av TSVer og supramolekulære angrepspartikler og deres komponenter. Vi har testet denne teknologien på forskjellige T-celler, inkludert forhåndsaktivert TH, CTL, Tregs og CART15. Denne protokollen fungere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til våre laboratoriemedlemmer og Kennedy Institute of Rheumatology samfunnet for konstruktive vitenskapelige diskusjoner, spesielt vår flyt cytometri anlegget leder Jonathan Webber. Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) og Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle tre til MLD). PFCD ble støttet av EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, i forbindelse med Europakommisjonen (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) og Marie Sklodowska-Curie Actions) og et Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404C-25mg | 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform |
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL |
Gilson | FA10011 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375C-25mg | 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | DOPE ATTO 390 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 | ATTO-TEC | AD 488-165 | DOPE ATTO 488 |
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 | ATTO-TEC | AD 565-165 | DOPE ATTO 565 |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C-25mg | 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform |
| 200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack | Starlab | S1111-0206 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon® | 352052 | |
| 5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories Inc. | SS05003 | |
| 96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3799 | For FCM staining and co-culture of BSLB and cells. |
| 96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. | Costar® | 3894 | For FCM staining of cells or beads in suspension. |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | A37573 and A20006 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | For normal in tube staining of biological samples for FCM | |
| Aluminum Foil | Any brand | For protecting cells and BSLBs from light | |
| anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 | BioLegend | 310815 and 310818 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 | BioLegend | 356934 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 | BioLegend | 302234 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD2, clone RPA-2.10 | BioLegend | 300202 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD2, clone TS1/8 | BioLegend | 309218 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 | BioLegend | Alexa Fluor 647 conjugate | |
| anti-human CD28, clone CD28.2 | eBioscience | 16-0289-85 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 53-3179-42 | Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E. |
| anti-human CD38, clone HB-7 | BioLegend | 356624 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD38, clone HIT2 | BioLegend | 303514 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD39, clone A1 | BioLegend | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 | BioLegend | 317436 | For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E |
| anti-human CD4, clone A161A1 | BioLegend | 357414 and 357421 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD4, clone OKT4 | BioLegend | 317414 and 317422 | PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD40, clone 5C3 | BioLegend | 334304 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD40, clone G28.5 | BioLegend | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | |
| anti-human CD45, clone HI30 | BioLegend | 304056 and 368516 | Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates |
| anti-human CD47, clone CC2C6 | BioLegend | 323118 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 | BioLegend | 353020 and 353015 | PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively |
| anti-human CD73, clone AD2 | BioLegend | 344002 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human CD80, clone 2D10 | BioLegend | 305216 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD81, clone 5A6 | BioLegend | 349512 and 349502 | PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively. |
| anti-human CD82, clone ASL-24 | BioLegend | 342108 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD86, clone IT2.2 | BioLegend | 305416 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human CD8a, clone HIT8a | BioLegend | 300920 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human CD8a, clone SK1 | BioLegend | 344724 | Alexa Fluor 700 conjugate |
| anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 | BioLegend | 311414 and 311402 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human HLA-DR, clone L243 | BioLegend | 307656 and 307622 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| anti-human ICAM-1, clone HCD54 | BioLegend | 322702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human ICOS, clone C398.4A | BioLegend | 313516 | Armenian Hamster IgG |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human ICOSL, clone MIH12 | eBioscience | 16-5889-82 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human LFA-1, clone TS1/22 | BioLegend | Produced in house | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) | BioLegend | 350018 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 | BioLegend | 135230 and 329902 | Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 | BioLegend | 329702 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 | BioLegend | 329611 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| anti-human PD-L2, clone MIH18 | BioLegend | 345502 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| anti-human TCRab, clone IP26 | BioLegend | 306712 and 306714 | Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively. |
| antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 | BioLegend | 352702 | |
| antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E | BioLegend | 348404 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 | BioLegend | 400902 | Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| BD Cytometer Setup and Tracking beads | Becton Dickinson & Company (BD) | 641319 | Performance track of instruments before quantitative FCM |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson & Company (BD) | 23-14523-00 | Acquisition software |
| Bovine Seum Albumin | Merck, Sigma-Aldrich | A3294 | |
| CaCl2, Calcium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | C5670 | anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% |
| Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder | Merck, Sigma-Aldrich | C5890 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11132D | |
| DynaMag-2 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12321D | For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL |
| DynaMag™-15 | ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ | 12301D | For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL |
| Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot | ThermoFisher Scientific, Gibco | A3160801 | Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva, GE Healthcare | GE17-1440-02 | Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | For the exclusion of dead cells during analyses |
| FlowJo | Becton Dickinson & Company (BD) | Version 10.7.1 | Analysis software |
| Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker | Keison Products | MPS-1 | For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation) |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-056 | |
| HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. | Merck, Sigma-Aldrich | H4034 | For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture |
| HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 51026282 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Hula Mixer® Sample Mixer | ThermoFisher Scientific, Life Technologies | 15920D | Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings. |
| Human Serum Albumin, 30% aqueous solution | Merck, Sigma-Aldrich | 12667-M | |
| Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution | BioLegend | 422302 | Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples |
| Innovatis CASY cell counter and analyzer TT | Biovendis Products GmbH | For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current. | |
| KCl, Potassium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | P5405 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 25030-024 | |
| MgCl2, Magessium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | M2393 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture |
| Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes | Keison Products | P-2-24 | Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker |
| Mini Incubator | Labnet International | I5110A-230V | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2 |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11140-035 | |
| Mouse IgG polyclonal antibody control | Merck, Sigma-Aldrich | PP54 | Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 | Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively. |
| Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 | Becton Dickinson & Company (BD), Horizon | 562438 | Brilliant Violet 421 conjugate. |
| Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 | eBioscience | 14-4714-82 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 | BioLegend | 400240 | Alexa Fluor 647 conjugate |
| Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 | BioLegend | 400330 and 400355 | Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively |
| Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma | Falcon | 353046 | For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells. |
| Na2HPO4, Disodium Phosphate | Merck, Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl, Sodium chloride | Merck, Sigma-Aldrich | S5886 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% |
| NiSO4, Nickel(II) sulfate | Merck, Sigma-Aldrich | 656895 | For saturating NTA sites; added during the blocking process |
| Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile | ThermoFisher Scientific, Gibco | 10010 | No Ca2+ or Mg2+ added |
| Polyethersulfone (PES) Filter unit | Thermo Scientific Nalgene | UY-06730-43 | Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content |
| PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar | BOC Ltd. | 11-Y | For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC. |
| Purified Streptavidin | BioLegend | 280302 | |
| Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 488 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads | Bangs Laboratories Inc. | 647 | Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB |
| Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 | ThermoFisher Scientific, invitrogen | SA1-25258 | Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02-1MG | |
| RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine | ThermoFisher Scientific, Gibco | 31870-025 | |
| Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15064 | Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations |
| Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15022C.1 | |
| Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15361 | Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS. |
| Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15063 | |
| RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11835-063 | For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements. |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific, Gibco | 11360-070 | |
| Sprout mini centrifuge | FisherScientific, Heathrow Scientific LLC | 120301 | Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes. |
| Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | ThermoFisher Scientific, invitrogen | 01-2222-42 | |
| Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | 89882 |
References
- Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
- Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
- Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528 (2019).
- Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
- Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
- Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
- Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Counting cells using a hemocytometer. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021)
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
- Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367 (2020).
- Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
- Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
- Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).
