Mønster av mikroorganismer og mikropartikler gjennom sekvensiell kapillaritetsassistert montering
Summary
Vi presenterer en teknologi som bruker kapillæritetsassistert montering i en mikrofluidisk plattform for å mønstre mikrostore gjenstander suspendert i en væske, for eksempel bakterier og kolloider, i foreskrevne matriser på et polydimetylsiloksansubstrat.
Abstract
Kontrollert mønster av mikroorganismer i definerte romlige ordninger gir unike muligheter for et bredt spekter av biologiske anvendelser, inkludert studier av mikrobiell fysiologi og interaksjoner. På det enkleste nivået vil nøyaktig romlig mønster av mikroorganismer muliggjøre pålitelig, langsiktig avbildning av et stort antall individuelle celler og forvandle evnen til kvantitativt å studere avstandsavhengige mikrobemikrobeinteraksjoner. Mer unikt vil kobling av nøyaktig romlig mønster og full kontroll over miljøforholdene, som tilbys av mikrofluidisk teknologi, gi en kraftig og allsidig plattform for encellede studier i mikrobiell økologi.
Dette dokumentet presenterer en mikrofluidisk plattform for å produsere allsidige og brukerdefinerte mønstre av mikroorganismer i en mikrofluidisk kanal, noe som gir fullstendig optisk tilgang for langsiktig overvåking av høy gjennomstrømning. Denne nye mikrofluidiske teknologien er basert på kapillæritetsassistert partikkelmontering og utnytter kapillærkreftene som oppstår fra den kontrollerte bevegelsen av en fordampende suspensjon inne i en mikrofluidisk kanal for å deponere individuelle mikrosized objekter i en rekke feller mikrofabricated på en polydimetylsiloxan (PDMS) substrat. Sekvensielle avsetninger genererer ønsket romlig layout av enkelt- eller flere typer mikrostore objekter, diktert utelukkende av geometrien til fellene og fyllingssekvensen.
Plattformen har blitt kalibrert ved hjelp av kolloidale partikler av forskjellige dimensjoner og materialer: det har vist seg å være et kraftig verktøy for å generere forskjellige kolloidale mønstre og utføre overflatefunksjonalisering av fanget partikler. Videre ble plattformen testet på mikrobielle celler, ved hjelp av Escherichia coli-celler som modellbakterie. Tusenvis av individuelle celler ble mønstret på overflaten, og veksten ble overvåket over tid. I denne plattformen tillater koblingen av encellet avsetning og mikrofluidisk teknologi både geometrisk mønster av mikroorganismer og presis kontroll av miljøforhold. Det åpner dermed et vindu inn i fysiologien til enkeltmikrober og økologien til mikrobe-mikrobe interaksjoner, som vist ved foreløpige eksperimenter.
Introduction
Romlig mønster av enkeltmikroorganismer, spesielt innenfor eksperimentelle arenaer som muliggjør full kontroll over miljøforhold, som mikrofluidiske enheter, er svært ønskelig i et bredt spekter av sammenhenger. For eksempel vil det å arrangere mikroorganismer i vanlige matriser tillate nøyaktig avbildning av et stort antall individuelle celler og studiet av vekst, fysiologi, genuttrykk som svar på miljøstimuli og narkotikafølsomhet. Det vil også tillate å studere cellecelleinteraksjoner av spesiell interesse for forskning på cellulær kommunikasjon (f.eks. quorumssensor), kryssfôring (f.eks. algebakteriell symbiose) eller antagonisme (f.eks. allelopati), med full kontroll over den romlige lokaliseringen av celler i forhold til hverandre. Cellefysiologi og evolusjonsstudier1, cellecelleinteraksjonsstudier2, fenotypisk differensieringsscreening3, miljøovervåking4 og legemiddelscreening5 er blant feltene som i stor grad kan dra nytte av en teknologi som er i stand til å oppnå en slik kvantitativ encellet analyse.
Flere strategier for å isolere og håndtere enkeltceller har blitt foreslått de siste årene, fra holografiske optiske feller6 og heterogene overflatefunksjonaliseringsmetoder7,8,9,10 til encellede kjemostater11 og dråpemikrofluidikk12. Disse metodene er enten teknisk svært krevende eller påvirker cellefysiologi og klarer ikke å gi en plattform med høy gjennomstrømning for å mønstre mikrober som kan studeres over lange perioder, noe som sikrer encellet oppløsning, full optisk tilgang og kontroll over miljøforholdene. Målet med dette dokumentet er å beskrive en plattform for å mønstre bakterier med mikrometrisk presisjon i foreskrevne romlige ordninger på en PDMS-overflate gjennom kapillæritetsassistert montering. Denne plattformen tillater presis og fleksibel romlig mønster av mikrober og muliggjør full optisk tilgang og kontroll over miljøforholdene, takket være dens mikrofluidiske natur.
Teknologien bak denne plattformen er en monteringsteknologi utviklet de siste årene, kalt sCAPA13,14,15 (sekvensiell kapillæritetsassistert partikkelmontering) som ble integrert i en mikrofluidisk plattform16. Menisken til en fordampende væskedråpe, mens den trekker seg tilbake over et mønstret polydimetylsiloksan (PDMS) substrat inne i en mikrofluidisk kanal, utøver kapillære krefter som fanger de enkelte kolloidale partiklene suspendert i væsken i mikrometriske brønner mikrofabricated på substratet (figur 1A). Suspenderte partikler transporteres først til luftvæskegrensesnittet ved konvektive strømmer og plasseres deretter i fellene etter kapillæritet. Kapillære krefter utøvet av den bevegelige menisken virker i større skala sammenlignet med krefter involvert i partikkelinteraksjoner.
Dermed påvirkes monteringsmekanismen ikke av partiklenes materiale, dimensjoner og overflateegenskaper. Parametere som partikkelkonsentrasjon, hastigheten på menisken, temperaturen og overflatespenningen til suspensjonen er de eneste parametrene som påvirker utbyttet av mønsterprosessen. Leseren kan finne en detaljert beskrivelse av påvirkningen av de nevnte parametrene på mønsterprosessen i13,14,15. I den opprinnelige sCAPA-teknologien13,14,15 ble den kolloidale mønsterprosessen utført i et åpent system og krevde et høypresisjons piezoelektrisk stadium for å drive suspensjonen over malen. Denne plattformen utnytter en annen strategi og gjør det mulig å utføre mønsteret med standardutstyr som vanligvis brukes i mikrofluidikk i et kontrollert miljø, og dermed minimere risikoen for å forurense prøvene.
Denne mikrofluidiske plattformen ble først optimalisert på kolloidale partikler for å skape vanlige matriser av inert partikler og deretter vellykket påført bakterier. Begge mikrofluidiske plattformer er beskrevet i dette dokumentet (figur 1B,C). De fleste forberedende trinnene og det eksperimentelle utstyret som er beskrevet i protokollen, er vanlige for de to bruksområdene (figur 2). Vi rapporterer kolloidal mønster for å demonstrere at teknikken kan brukes til å utføre flere sekvensielle avsetninger på samme overflate for å skape komplekse, multimateriale mønstre. Spesielt ble en enkelt partikkel avsatt per felle for hvert trinn for å danne kolloidale matriser med en bestemt geometri og sammensetning, utelukkende diktert av fellenes geometri og fyllingssekvens. Når det gjelder bakteriell mønster, beskrives enkle avsetninger, noe som resulterer i at en bakterie blir avsatt per felle. Når cellene er mønstret på overflaten, skylles den mikrofluidiske kanalen med medium for å fremme bakterievekst, det foreløpige trinnet i en enkeltcellet studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikrofluidiske plattformen som er beskrevet her, tillater mønster av mikrostore gjenstander, for eksempel kolloider og bakterier, til foreskrevne romlige ordninger på et PDMS-substrat. Full kontroll over miljøforholdene som tilbys av mikrofluidikk og evnen til å mønstre celler med mikrometrisk presisjon gitt av sCAPA-teknologi, gjør det til en svært lovende plattform for fremtidige fysiologi- og økologistudier.
I forsøkene som ble presentert i dette arbeidet, ble silisiummesteren …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner støtte fra SNSF PRIMA grant 179834 (til E.S.), et ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.), og en Gordon og Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). Forfatterne takker Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Universitetet i Granada, Spania) for SEM-avbildning av bakterier og for innsiktsfulle diskusjoner. Forfatterne takker Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Canada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Sveits), Cameron Boggon (ETH Zürich, Sveits) og Dr. Fabio Grillo for innsiktsfulle diskusjoner.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
