Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità
Summary
Presentiamo una tecnologia che utilizza l’assemblaggio assistito dalla capillarità in una piattaforma microfluidica per modellare oggetti di dimensioni micro sospesi in un liquido, come batteri e colloidi, in matrici prescritte su un substrato di polidimetilsilossano.
Abstract
La modellazione controllata dei microrganismi in disposizioni spaziali definite offre possibilità uniche per una vasta gamma di applicazioni biologiche, compresi studi di fisiologia microbica e interazioni. Al livello più semplice, un accurato pattern spaziale dei microrganismi consentirebbe l’imaging affidabile e a lungo termine di un gran numero di singole cellule e trasformerebbe la capacità di studiare quantitativamente le interazioni microbo-microbo dipendenti dalla distanza. Più unicamente, l’accoppiamento di modelli spaziali accurati e il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come offerto dalla tecnologia microfluidica, fornirebbe una piattaforma potente e versatile per studi su singole cellule in ecologia microbica.
Questo documento presenta una piattaforma microfluidica per produrre modelli versatili e definiti dall’utente di microrganismi all’interno di un canale microfluidico, consentendo un accesso ottico completo per il monitoraggio a lungo termine e ad alta produttività. Questa nuova tecnologia microfluidica si basa sull’assemblaggio di particelle assistito dalla capillarità e sfrutta le forze capillari derivanti dal movimento controllato di una sospensione evaporante all’interno di un canale microfluidico per depositare singoli oggetti di dimensioni micrometriche in una serie di trappole microfabbricate su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS). Le deposizioni sequenziali generano il layout spaziale desiderato di singoli o più tipi di oggetti di dimensioni micro, dettato esclusivamente dalla geometria delle trappole e dalla sequenza di riempimento.
La piattaforma è stata calibrata utilizzando particelle colloidali di diverse dimensioni e materiali: ha dimostrato di essere un potente strumento per generare diversi modelli colloidali ed eseguire la funzionalizzazione superficiale delle particelle intrappolate. Inoltre, la piattaforma è stata testata su cellule microbiche, utilizzando cellule di Escherichia coli come batterio modello. Migliaia di singole cellule sono state modellate sulla superficie e la loro crescita è stata monitorata nel tempo. In questa piattaforma, l’accoppiamento della deposizione monocellulare e della tecnologia microfluidica consente sia la modellazione geometrica dei microrganismi che il controllo preciso delle condizioni ambientali. Apre così una finestra sulla fisiologia dei singoli microbi e sull’ecologia delle interazioni microbo-microbo, come dimostrato da esperimenti preliminari.
Introduction
La modellazione spaziale di singoli microrganismi, in particolare all’interno di arene sperimentali che consentono il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come i dispositivi microfluidici, è altamente auspicabile in una vasta gamma di contesti. Ad esempio, organizzare i microrganismi in array regolari consentirebbe l’imaging accurato di un gran numero di singole cellule e lo studio della loro crescita, fisiologia, espressione genica in risposta a stimoli ambientali e suscettibilità ai farmaci. Consentirebbe inoltre di studiare le interazioni cellula-cellula di particolare interesse nella ricerca sulla comunicazione cellulare (ad esempio, quorum sensing), cross-feeding (ad esempio, simbiosi algale-batterica) o antagonismo (ad esempio, allelopatia), con pieno controllo sulla localizzazione spaziale delle cellule l’una rispetto all’altra. Gli studi di fisiologia ed evoluzione cellulare1, gli studi di interazione cellula-cellula2, lo screening fenotipico della differenziazione3, il monitoraggio ambientale4 e lo screening farmacologico5 sono tra i campi che possono trarre grande beneficio da una tecnologia in grado di ottenere tale analisi quantitativa a singola cellula.
Negli ultimi anni sono state proposte diverse strategie per isolare e gestire singole cellule, dalle trappole ottiche olografiche6 e metodi di funzionalizzazione di superficie eterogenei7,8,9,10 ai chemiostati monocellulari11 e alla microfluidica delle goccioline12. Questi metodi sono tecnicamente molto impegnativi o influenzano la fisiologia cellulare e non riescono a fornire una piattaforma ad alto rendimento per modellare i microbi che possono essere studiati per lunghi periodi, garantendo la risoluzione a singola cellula, il pieno accesso ottico e il controllo sulle condizioni ambientali. L’obiettivo di questo documento è descrivere una piattaforma per modellare i batteri con precisione micrometrica in disposizioni spaziali prescritte su una superficie PDMS attraverso l’assemblaggio assistito dalla capillarità. Questa piattaforma consente una modellazione spaziale precisa e flessibile dei microbi e consente l’accesso ottico completo e il controllo delle condizioni ambientali, grazie alla sua natura microfluidica.
La tecnologia alla base di questa piattaforma è una tecnologia di assemblaggio sviluppata negli ultimi anni, denominata sCAPA13,14,15 (sequenziale capillarity-assisted particle assembly) che è stata integrata in una piattaforma microfluidica16. Il menisco di una goccia liquida evaporante, mentre si ritira su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) modellato all’interno di un canale microfluidico, esercita forze capillari che intrappolano le singole particelle colloidali sospese nel liquido in pozzi micrometrici microfabbricati sul substrato (Figura 1A). Le particelle sospese vengono prima trasportate all’interfaccia aria-liquido da correnti convettive e quindi collocate nelle trappole per capillarità. Le forze capillari esercitate dal menisco in movimento agiscono su una scala più ampia rispetto alle forze coinvolte nelle interazioni particellarie.
Pertanto, il meccanismo di assemblaggio non è influenzato dal materiale, dalle dimensioni e dalle proprietà superficiali delle particelle. Parametri come la concentrazione delle particelle, la velocità del menisco, la temperatura e la tensione superficiale della sospensione sono gli unici parametri che influenzano la resa del processo di patterning. Il lettore può trovare una descrizione dettagliata dell’influenza dei suddetti parametri sul processo di patterning in13,14,15. Nella tecnologia sCAPA originale13,14,15, il processo di pattern colloidale veniva eseguito in un sistema aperto e richiedeva uno stadio piezoelettrico ad alta precisione per guidare la sospensione attraverso il modello. Questa piattaforma sfrutta una strategia diversa e consente di effettuare il patterning con apparecchiature standard generalmente utilizzate in microfluidica in ambiente controllato, riducendo così al minimo i rischi di contaminazione dei campioni.
Questa piattaforma microfluidica è stata inizialmente ottimizzata su particelle colloidali per creare matrici regolari di particelle inerti e poi applicata con successo ai batteri. Entrambe le piattaforme microfluidiche sono descritte in questo articolo (Figura 1B,C). La maggior parte delle fasi preparatorie e le apparecchiature sperimentali descritte nel protocollo sono comuni per le due applicazioni (Figura 2). Riportiamo modelli colloidali per dimostrare che la tecnica può essere utilizzata per eseguire più deposizioni sequenziali sulla stessa superficie per creare modelli complessi e multimateriali. In particolare, una singola particella è stata depositata per trappola per ogni passo per formare matrici colloidali con una geometria e una composizione specifiche, dettate esclusivamente dalla geometria e dalla sequenza di riempimento delle trappole. Per quanto riguarda il pattern batterico, vengono descritte singole deposizioni, con conseguente deposito di un batterio per trappola. Una volta che le cellule sono modellate sulla superficie, il canale microfluidico viene lavato con il mezzo per promuovere la crescita batterica, la fase preliminare di qualsiasi studio a singola cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
La piattaforma microfluidica qui descritta consente la modellazione di oggetti di dimensioni micro, come colloidi e batteri, in disposizioni spaziali prescritte su un substrato PDMS. Il pieno controllo sulle condizioni ambientali offerto dalla microfluidica e la capacità di modellare le cellule con precisione micrometrica garantita dalla tecnologia sCAPA lo rendono una piattaforma molto promettente per futuri studi di fisiologia ed ecologia.
Negli esperimenti presentati in questo lavoro, il m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno della sovvenzione SNSF PRIMA 179834 (a E.S.), una sovvenzione di ricerca ETH ETH-15 17-1 (R. S.) e un Gordon and Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (sovvenzione GBMF9197) (R. S.). Gli autori ringraziano il Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Università di Granada, Spagna) per l’imaging SEM dei batteri e per le discussioni approfondite. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Jen Nguyen (Università della British Columbia, Canada), la Dott.ssa Laura Alvarez (ETH zurigo, Svizzera), Cameron Boggon (ETH Zurigo, Svizzera) e il Dott. Fabio Grillo per le discussioni approfondite.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
