Iniezione di cellule stroma derivate dal tessuto adiposo suino tramite tecnologia Waterjet
Summary
Presentiamo un metodo di iniezione cellulare tramite tecnologia waterjet senza ago accoppiato con una sequela di indagini post-parto in termini di vitalità cellulare, proliferazione ed misure di elasticità.
Abstract
L’incontinenza urinaria (UI) è una condizione altamente prevalente caratterizzata dalla carenza del muscolo sfintere uretrale. I rami della medicina rigenerativa, in particolare la terapia cellulare, sono nuovi approcci per migliorare e ripristinare la funzione dello sfintere uretrale. Anche se l’iniezione di cellule funzionali attive viene eseguita di routine in contesti clinici con ago e siringa, questi approcci presentano svantaggi e limitazioni significativi. In questo contesto, la tecnologia waterjet (WJ) senza ago è un metodo fattibile e innovativo in grado di iniettare cellule vitali mediante cistoscopia guidata visivamente nello sfintere uretrale. Nel presente studio, abbiamo utilizzato WJ per fornire cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino (pADSC) nel tessuto uretrale cadaverico e successivamente abbiamo studiato l’effetto della consegna di WJ sulla resa cellulare e sulla vitalità. Abbiamo anche valutato le caratteristiche biomeccaniche (cioè l’elasticità) mediante misurazioni al microscopio a forza atomica (AFM). Abbiamo dimostrato che le pADSC consegnate da WJ erano significativamente ridotte nella loro elasticità cellulare. La redditività è stata significativamente inferiore rispetto ai controlli, ma è ancora superiore all’80%.
Introduction
L’incontinenza urinaria (UI) è una malattia diffusa con una prevalenza dell’1,8 – 30,5% nelle popolazioni europee1 ed è caratterizzata principalmente da malfunzionamenti dello sfintere uretrale. Da un punto di vista clinico, il trattamento chirurgico viene spesso offerto ai pazienti quando le terapie conservative o la fisioterapia non riescono ad affrontare e alleviare i sintomi emergenti.
La terapia cellulare per la potenziale riparazione rigenerativa del malfunzionamento del complesso sfinterico sta emergendo come approccio all’avanguardia per il trattamento della patologia UI 2,3. I suoi obiettivi principali sono sostituire, riparare e ripristinare la funzionalità biologica del tessuto danneggiato. Nei modelli animali per l’UI, il trapianto di cellule staminali ha mostrato risultati promettenti in esiti urodinamici 2,4,5. Le cellule staminali si presentano come candidati cellulari ottimali in quanto hanno la capacità di subire l’auto-rinnovamento e la differenziazione multipotente, aiutando così la rigenerazione del tessuto interessato6. Nonostante l’imminente potenziale rigenerativo, l’uso pratico della terapia cellulare rimane ostacolato poiché la somministrazione minimamente invasiva di cellule deve ancora affrontare diverse sfide riguardanti la precisione dell’iniezione e la copertura del bersaglio. Anche se l’attuale approccio utilizzato per la consegna cellulare è l’iniezione attraverso un sistema di siringa ad ago7, di solito si traduce in un deficit complessivo di cellule vitali, con viabilità segnalate a partire dall’1% al 31% dopo il trapianto8. Inoltre, la somministrazione di cellule tramite iniezione con ago ha anche dimostrato di influenzare il posizionamento, il tasso di ritenzione e la distribuzione delle cellule trapiantate nel tessuto bersaglio 9,10,11. Un approccio fattibile e nuovo che supera la limitazione di cui sopra è la consegna di cellule senza ago tramite la tecnologia a getto d’acqua.
La tecnologia Waterjet (WJ) sta emergendo come un nuovo approccio che consente la consegna ad alto rendimento delle cellule tramite cistoscopio sotto controllo visivo nello sfintere uretrale12,13. Il WJ consente l’erogazione di celle a diverse pressioni (E = effetti in bar) che vanno da E5 a E8013. Nella prima fase, (fase di penetrazione tissutale) la soluzione isotonica viene applicata ad alta pressione (cioè E60 o E80) al fine di allentare la matrice extracellulare che circonda il tessuto bersaglio e aprire piccole micro-lacune interconnesse. Nella seconda fase (la fase di iniezione), la pressione viene abbassata entro millisecondi (cioè fino a E10) per consegnare delicatamente le cellule nel tessuto bersaglio. A seguito di questa applicazione in due fasi, le cellule non sono sottoposte a pressione aggiuntiva contro il tessuto quando vengono espulse, ma galleggiano in un flusso a bassa pressione in un’area cavernosa piena di liquido13. In un ambiente modello ex vivo in cui le cellule staminali sono state iniettate tramite WJ nel tessuto cadaverico dell’uretra, le cellule vitali potrebbero essere successivamente aspirate e recuperate dal tessuto e ulteriormente espanse in vitro13. Sebbene uno studio del 2020 di Weber et al. abbia dimostrato la fattibilità e l’applicabilità di WJ per fornire cardiomiociti privi di impronta nel miocardio14, va tenuto presente che la tecnologia WJ è ancora in fase di prototipo.
Il seguente protocollo descrive come preparare ed etichettare le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo suino (pADSC) e come consegnarle nel fluido di cattura e nel tessuto cadaverico tramite la tecnologia WJ e gli aghi per cistoscopia Williams (WN). Dopo l’iniezione cellulare, viene valutata la vitalità e l’elasticità cellulare tramite microscopia a forza atomica (AFM). Tramite istruzioni dettagliate, il protocollo fornisce un approccio chiaro e conciso per acquisire dati affidabili. La sezione di discussione presenta e descrive i principali vantaggi, limiti e prospettive future della tecnica. La consegna delle cellule WJ e le analisi post traduzione della sequela riportate qui stanno sostituendo l’iniezione standard dell’ago e forniscono un quadro di consegna delle cellule solide per la guarigione rigenerativa del tessuto bersaglio. Nei nostri recenti studi abbiamo fornito prove che WJ ha consegnato le cellule in modo più preciso e almeno con una vitalità comparabile rispetto alle iniezioni di ago15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente studio, abbiamo dimostrato e presentato un approccio graduale per la procedura di consegna delle cellule WJ e abbiamo impiegato una sequela di indagini quantitative per valutare l’effetto della consegna di WJ sulle caratteristiche cellulari: vitalità cellulare e caratteristiche biomeccaniche (cioè EM). Dopo l’iniezione di WJ, l’85,9% delle cellule raccolte era vitale. In termini di iniezione di WN, il 97,2% delle cellule ha mantenuto la propria vitalità dopo l’iniezione. Pertanto, l’approccio WJ soddisfa …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto.
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 – 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 – 20 kHz) Length: 500 µm (490 – 510 µm) Width: 30 µm (35 – 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 – 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish – CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
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