次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離
Summary
このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率に最適化されたマウス生後網膜内皮細胞の単離方法について説明しています。これらの細胞は、次世代シーケンシングアプローチに適しています。
Abstract
次世代シーケンシングの最近の改善により、分子生物学および細胞生物学に関する研究者の知識が進歩し、いくつかの研究により血管生物学の新しいパラダイムが明らかになりました。これらの方法を血管発生のモデルに適用するには、胚および出生後の組織からの細胞分離技術の最適化が必要です。細胞収量、生存率、純度はすべて、次世代シーケンシングアプローチから正確で再現性のある結果を得るために最大である必要があります。新生児マウス網膜血管新生モデルは、血管発生のメカニズムを研究するために研究者によって使用されます。研究者は、このモデルを使用して、血管形成および成熟中の血管新生および動脈静脈運命の仕様のメカニズムを調査しました。次世代シーケンシング技術を適用して網膜血管発生モデルを研究するには、細胞収量、生存率、および純度を最大化する網膜内皮細胞の単離方法の最適化が必要です。このプロトコルは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用したマウス網膜組織の単離、消化、および精製の方法について説明しています。結果は、FACS精製CD31+/CD45-内皮細胞集団が内皮細胞の遺伝子発現に対して高度に濃縮されており、FACS後60分間生存率に変化を示さないことを示しています。バルクRNAシーケンシングやシングルセルRNAシーケンシングなど、この方法を使用して単離された内皮細胞に対する次世代シーケンシングアプローチの代表的な結果が含まれており、網膜内皮細胞単離のためのこの方法が次世代シーケンシングアプリケーションと互換性があることを示しています。網膜内皮細胞単離のこの方法は、血管発生の新しいメカニズムを明らかにするための高度なシーケンシング技術を可能にします。
Introduction
次世代シーケンシングアプローチによる核酸シーケンシングのハイスループット能力は、分子生物学および細胞生物学に関する研究者の知識を大幅に進歩させました。これらの高度な技術には、全トランスクリプトームRNAシーケンシング、一塩基多型(SNP)を特定するための標的領域のDNAシーケンシング、クロマチン免疫沈降(ChIP)シーケンシングにおける結合転写因子のDNAシーケンシング、またはトランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(ATAC)シーケンシングのアッセイにおけるオープンクロマチン領域、およびシングルセルRNAシーケンシングが含まれます1.血管生物学では、これらの進歩により、研究者は発生と疾患の複雑なメカニズムを解明し、さまざまな表現型の連続体に沿って遺伝子発現パターンを区別することができました2,3。将来の実験では、次世代シーケンシングと血管発生の評価モデルを組み合わせることで複雑なメカニズムをさらに定義できますが、サンプル調製の方法は高度なシーケンシング技術と互換性がある必要があります。
次世代シーケンシングアプローチの品質、精度、再現性は、サンプル調製の方法によって異なります。細胞のサブセットを単離したり、組織から単一細胞懸濁液を生成したりする場合、細胞集団の細胞数、生存率、および純度を最大化するには、最適な消化および精製方法が不可欠です4,5。これには消化方法のバランスが必要です:組織から細胞を放出し、下流のアプローチに十分な細胞を得るためには強力な消化が必要ですが、消化が強すぎると細胞の生存率に悪影響を及ぼします6,7。さらに、細胞集団の純度は、堅牢な結果とデータの正確な分析に必要であり、FACSを通じて達成できます。これは、血管発生の確立されたモデルに次世代シーケンシングを適用するために、細胞分離方法を最適化することの重要性を浮き彫りにしています。
血管の発達を調べるための十分に特徴付けられたモデルは、マウス網膜血管発達モデルです。マウス網膜血管系は出生後に2次元の表在神経叢で発達し、出生後(P)3に視神経からの最初の血管新生が見られ、P6に茎細胞と先端細胞を伴う血管新生前部と初期血管成熟が見られ、P9後に血管叢の成熟が見られます8,9。初期血管神経叢のリモデリングの間、内皮細胞は、循環ネットワークを生成するために、異なる血管における動脈、毛細血管、および静脈表現型に向かって仕様化を受ける10、11。したがって、この方法は、研究者が血管新生血管叢形成および内皮動脈静脈の仕様および成熟を、発生中の様々な時点で視覚化することを可能にする9。さらに、このモデルは、血管新生および血管神経叢の発達に対するトランスジェニック操作の影響を調べるための方法を提供し、血管の発達、動脈静脈奇形、および酸素誘発性血管新生の研究に適用されています12,13,14,15,16。.次世代シーケンシングアプローチとマウス網膜血管発生モデルを組み合わせるには、網膜組織から内皮細胞を単離するための最適化されたプロトコルが必要です。
このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率を最大化するために、P6でマウスの網膜組織を消化するための最適化された方法を説明しています。網膜組織をP6マウスから単離し、20分間消化し、CD31およびCD45について免疫染色し、FACSを通して精製して、約2.5時間で内皮細胞の単一細胞懸濁液を単離した(図1A)。これらの内皮細胞は、単離後60分間高い生存率を維持することが判明し17、次世代シーケンシング法のためのライブラリ調製を可能にしました。さらに、この分離プロトコルを使用した2つの別々の次世代シーケンシングメソッド(全トランスクリプトームRNAシーケンシングとシングルセルRNAシーケンシング)からのFACSゲーティングおよび品質管理結果に関する代表的な結果が得られます。この方法により、次世代シーケンシングアプローチを網膜血管新生モデルと組み合わせて使用することで、血管発生の新しいメカニズムを解明することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、高い細胞数、純度、および生存率のために最適化された、出生後のマウス網膜組織から内皮細胞を単離する方法を説明しています。細胞純度は、CD31+/CD45-免疫染色による消化された単一細胞懸濁液からの内皮細胞集団のFACS単離によって得られます。単離の質は、トリパンブルー染色による生存率およびCD31、CD45、およびVE-カドヘリンのqPCRによる遺伝子発現のアッセイで定?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yale Flow Cytometry施設、バージニア大学フローサイトメトリーコア施設、Yale Center for Genomic Analysis、およびUniversity of Virginia Genome Analysis and Technology Coreの方々に、提示された実験に貢献するための努力、専門知識、アドバイスをいただき、ありがとうございます。この研究は、N.W.C.(T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650), およびK.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765)へのNIH助成金によって資金提供された。
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
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