مراقبة تحمض الأمعاء في أمعاء ذبابة الفاكهة البالغة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا موحدا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة مع الإخراج الأمثل. نستخدم هذا البروتوكول أولا لمراقبة تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ثم نظهر استخدامه في أنواع ذبابة الفاكهة غير النموذجية.
Abstract
تتكون ذبابة الفاكهة midgut من مناطق متعددة ، يتكون كل منها من خلايا تقوم بوظائف فسيولوجية فريدة مطلوبة لحسن سير العمل في الأمعاء. إحدى هذه المناطق ، منطقة الخلايا النحاسية (CCR) ، موضعية في منتصف الأمعاء الوسطى وتتكون ، جزئيا ، من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم الخلايا النحاسية. تشارك الخلايا النحاسية في إفراز حمض المعدة ، وهي عملية محفوظة تطوريا ودورها الدقيق غير مفهوم بشكل جيد. تصف هذه الورقة التحسينات في البروتوكول الحالي المستخدم لفحص تحمض أمعاء ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر البالغة وتوضح أنه يمكن استخدامه على أنواع أخرى من الذباب. على وجه الخصوص ، توضح هذه الورقة أن تحمض الأمعاء يعتمد على الحالة الغذائية للذبابة ويقدم بروتوكولا يعتمد على هذه النتيجة الجديدة. بشكل عام ، يوضح هذا البروتوكول الفائدة المحتملة لدراسة خلايا ذبابة الفاكهة النحاسية للكشف عن المبادئ العامة الكامنة وراء آليات تحمض الأمعاء.
Introduction
في أمعاء الحشرات ، تشترك الخلايا النحاسية في أوجه تشابه خلوية ووظيفية مع الخلايا الجدارية المعدية المنتجة للحمض (المعروفة أيضا باسم oxyntic) في معدة الثدييات. هذه المجموعة من الخلايا تطلق الحمض في تجويف الأمعاء. يتم الحفاظ على وظيفة إفراز الحمض والتشريح تطوريا. المكونات الرئيسية للحمض المفرغ هي حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم. تعتمد الآلية الكيميائية لتكوين الحمض في الخلايا على الأنهيدراز الكربوني. يولد هذا الإنزيم أيون بيكربونات من CO2 والماء ، والذي يحرر أيون الهيدروكسيل الذي يتم تفريغه بعد ذلك في التجويف من خلال مضخة بروتون مقابل البوتاسيوم. يتم نقل أيونات الكلوريد والبوتاسيوم إلى التجويف عن طريق قنوات التوصيل مما يؤدي إلى تكوين حمض الهيدروكلوريك وكلوريد البوتاسيوم ، المكون الرئيسي لعصير المعدة 1،2،3،4.
على الرغم من أن آليات تكوين الحمض مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن الآليات الفسيولوجية التي تنظم إفراز الحمض. الهدف من تطوير هذه الطريقة هو المساعدة في تحديد المسارات الخلوية التي تنسق تكوين الحمض وإفرازه بشكل أفضل وتحديد دور الحمض في التوسط في فسيولوجيا الأمعاء والتوازن. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو توفير طريقة متسقة وموثوقة لدراسة عملية تحمض الأمعاء في ذبابة الفاكهة والكائنات الحية غير النموذجية. على الرغم من وجود بروتوكول قياسي لتحديد تحمض ذبابة الفاكهة في منتصف الأمعاء حاليا2,5,6 ، فقد لوحظ تباين كبير في مدى التحمض في الذباب من النوع البري (WT) أثناء استخدام هذا البروتوكول لدراسة وظيفة الخلايا النحاسية. لفهم أساس هذا التباين الملحوظ والحصول على نتائج متسقة ، تم تحسين العديد من جوانب البروتوكول القياسي كما هو موضح أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي التشريح السليم للأمعاء لتصور CCR للنمط الظاهري للتحمض. يقتصر الحمض المنبعث من الخلايا النحاسية على CCR عندما تكون الأمعاء سليمة. ومع ذلك ، أثناء التشريح ، يمكن أن يؤدي التسرب الناجم عن تمزق الأمعاء إلى انتشار الحمض من CCR ويؤدي إلى تسجيل الأمعاء عن طريق الخط…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بأن الدعم للعمل في مختبر المؤلف يتم توفيره من خلال جائزة HHMI College Scholar Award وصناديق بدء التشغيل من معهد أبحاث الأطفال في مركز UT Southwestern الطبي.
Materials
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend, , et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell, , et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
