Мониторинг подкисления кишечника в кишечнике дрозофилы у взрослых
Summary
Здесь мы представляем стандартизированный протокол мониторинга подкисления кишечника у Drosophila melanogaster с оптимальной производительностью. Сначала мы используем этот протокол для мониторинга подкисления кишечника у Drosophila melanogaster , а затем демонстрируем его использование у немодельных видов Drosophila .
Abstract
Плодовая мошка состоит из нескольких областей, каждая из которых состоит из клеток, выполняющих уникальные физиологические функции, необходимые для правильного функционирования кишечника. Одна из таких областей, область медных ячеек (CCR), локализована в средней средней кишке и состоит, частично, из группы клеток, известных как медные клетки. Медные клетки участвуют в секреции желудочного сока, эволюционно сохраненном процессе, точная роль которого плохо изучена. В этой статье описываются улучшения в текущем протоколе, используемом для анализа на подкисление кишечника взрослой Drosophila melanogaster , и демонстрируется, что его можно использовать на других видах мух. В частности, эта статья демонстрирует, что подкисление кишечника зависит от питательного статуса мухи и представляет протокол, основанный на этом новом открытии. В целом, этот протокол демонстрирует потенциальную полезность изучения медных клеток дрозофилы для выявления общих принципов, лежащих в основе механизмов подкисления кишечника.
Introduction
В кишечнике насекомых медные клетки имеют клеточное и функциональное сходство с кислотообразующими желудочными париетальными клетками (также известными как оксинтические) желудка млекопитающих. Эта группа клеток высвобождает кислоту в просвет кишечника. Функция кислотной секреции и анатомии эволюционно сохраняется. Основными компонентами сбрасываемой кислоты являются соляная кислота и хлорид калия. Химический механизм кислотообразования в клетках зависит от карбоангидразы. Этот фермент генерирует бикарбонат-ион из CO2 и воды, который высвобождает гидроксильный ион, который затем выбрасывается в просвет через протонный насос в обмен на калий. Ионы хлорида и калия транспортируются в просвет по проводящим каналам, в результате чего образуются соляная кислота и хлорид калия, основной компонент желудочного сока1,2,3,4.
Хотя механизмы кислотообразования хорошо изучены, гораздо меньше известно о физиологических механизмах, регулирующих секрецию кислоты. Цель разработки этого метода состоит в том, чтобы помочь лучше очертить клеточные пути, которые координируют образование и секрецию кислоты и определить роль кислоты в опосредовании физиологии кишечника и гомеостаза. Обоснование разработки и использования этого метода заключается в обеспечении последовательного и надежного метода изучения процесса подкисления кишечника у дрозофил и немодельных организмов. Хотя стандартный протокол для определения подкисления средней кишки Drosophila в настоящее время существует 2,5,6, при использовании этого протокола для изучения функции медных клеток наблюдалась значительная вариабельность в степени подкисления у мух дикого типа (WT). Чтобы понять основу этой наблюдаемой изменчивости и получить последовательные результаты, несколько аспектов стандартного протокола были оптимизированы, как описано ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критическим шагом в этом протоколе является правильное рассечение кишечника для визуализации CCR для фенотипа подкисления. Кислота, высвобождаемая из медных клеток, ограничена CCR, когда кишечник неповрежден. Однако во время рассечения утечка, вызванная разрывом кишечника, может привес?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, что поддержку работе в авторской лаборатории оказывают премия HHMI Faculty Scholar Award и стартовые фонды Детского научно-исследовательского института при Юго-западном медицинском центре UT.
Materials
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| cellSens software | Olympus | Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens) | |
| D. simulans | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. erecta | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. pseudoobscura | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| D. mojavensis | Drosophila Species Stock Center at the University of California | Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/) | |
| Forceps | Inox Biology | Catalog# 11252-20 | |
| Fuji | Fuji | Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) | |
| Glass slide | VWR | Catalog#16005-108 | |
| Kim wipes Tissue | Kimtech | ||
| Microscope and camera | Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera | Imaging | |
| Oregon R | Bloomington Drosophila Stock | (https://bdsc.indiana.edu/ # 2376) | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Catalog #FB0875713A | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | HyClone | Catalog # SH30258.01 | |
| Stereomicroscope | Olympus SZ51 | Visual magnification |
References
- Hollander, F. The composition and mechanism of formation of gastric acid secretion. Science. 110 (2846), 57-63 (1949).
- Forte, J. G., Zhu, L. Apical recycling of the gastric parietal cell H, K-ATPase. Annual Review of Physiology. 72, 273-296 (2010).
- Samuelson, L. C., Hinkle, K. L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annual Review of Physiology. 65, 383-400 (2003).
- Yao, X., Forte, J. G. Cell biology of acid secretion by the parietal cell. Annual Review of Physiology. 65, 103-131 (2003).
- Driver, I., Ohlstein, B. Specification of regional intestinal stem cell identity during Drosophila metamorphosis. Development. 141 (9), 1848-1856 (2014).
- Overend, , et al. Molecular mechanism and functional significance of acid generation in the Drosophila midgut. Scientific Reports. 6, 27242 (2016).
- Shanbhag, S., Tripathi, S. Epithelial ultrastructure and cellular mechanisms of acid and base transport in the Drosophila midgut. Journal of Experimental Biology. 212, 1731-1744 (2009).
- Dubreuil, R. R. Copper cells and stomach acid secretion in the Drosophila midgut. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (5), 745-752 (2004).
- Martorell, , et al. Conserved mechanisms of tumorigenesis in the Drosophila adult midgut. PLoS ONE. 9 (2), 88413 (2014).
- Strand, M., Micchelli, C. A. Regional control of Drosophila gut stem cell proliferation: EGF establishes GSSC proliferative set point & controls emergence from quiescence. PLoS One. 8 (11), 80608 (2013).
- Storelli, G., et al. Drosophila perpetuates nutritional mutualism by promoting the fitness of its intestinal symbiont Lactobacillus plantarum. Cell Metabolism. 27 (2), 362-377 (2018).
- Abu, F., et al. Communicating the nutritional value of sugar in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2829-2838 (2018).
- Blecker, U., Gold, B. D. Gastritis and ulcer disease in childhood. European Journal of Pediatrics. 158 (7), 541-546 (1999).
