ओस्टियोब्लास्ट बायोएनर्जेटिक्स की निगरानी करने के लिए रियल-टाइम सेल मेटाबोलिक फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करना
Summary
वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स परख ऑक्सीजन की खपत दर और बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर, जो माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट उत्पादन से मेल खाती है, पीएच और ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग करके उपाय करती है। पांडुलिपि ओस्टियोब्लास्ट्स की ऊर्जा स्थिति और सेलुलर बायोएनर्जेटिक स्थिति के लक्षण वर्णन और व्याख्या को समझने के लिए एक विधि की व्याख्या करती है।
Abstract
ओस्टियोब्लास्ट्स द्वारा हड्डी का गठन कंकाल होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए उचित हड्डी अधिग्रहण और हड्डी के कारोबार के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है, और अंततः, फ्रैक्चर को रोकने के लिए। चोटी की हड्डी के द्रव्यमान को अनुकूलित करने और विभिन्न मस्कुलोस्केलेटल बीमारियों (यानी, रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस, एनोरेक्सिया नर्वोसा, टाइप 1 और 2 मधुमेह मेलिटस) का मुकाबला करने के लिए ब्याज में, हड्डी जीव विज्ञान के क्षेत्र में अविश्वसनीय प्रयास किए गए हैं ताकि उनकी भेदभाव प्रक्रिया के दौरान ओस्टियोब्लास्ट को पूरी तरह से चिह्नित किया जा सके। मैट्रिक्स प्रोटीन और खनिज पुटिकाओं को स्रावित करने के लिए परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट की प्राथमिक भूमिका को देखते हुए, यह ध्यान दिया गया है कि ये प्रक्रियाएं सेलुलर ऊर्जा, या एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की अविश्वसनीय मात्रा लेती हैं। समग्र सेलुलर ऊर्जा की स्थिति को अक्सर सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स के रूप में जाना जाता है, और इसमें चयापचय प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला शामिल होती है जो सेलुलर आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एटीपी प्राप्त करने के लिए सब्सट्रेट उपलब्धता को समझती है। इसलिए, वर्तमान विधि प्राथमिक, मुरीन अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं (बीएमएससी) को अलग करने और ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव में विभिन्न चरणों में वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके उनकी बायोएनर्जेटिक स्थिति की निगरानी करने की प्रक्रिया का विवरण देती है। महत्वपूर्ण रूप से, इन आंकड़ों ने प्रदर्शित किया है कि ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दौरान चयापचय प्रोफ़ाइल नाटकीय रूप से बदलजाती है। इस प्रकार, इस शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार का उपयोग पूरी तरह से सराहना करने के लिए आवश्यक है कि सेल की बायोएनर्जेटिक स्थिति समग्र कार्य को कैसे विनियमित कर सकती है।
Introduction
ओस्टियोब्लास्ट द्वारा हड्डी का गठन ओस्टियोक्लास्ट द्वारा समन्वित विनाश या हड्डियों के अवशोषण के साथ होता है। ओस्टियोब्लास्टिक हड्डी के गठन और ओस्टियोक्लास्ट अवशोषण के बीच संतुलन हड्डी के कारोबार या रीमॉडलिंग का वर्णन करने वाली एक युग्मित प्रक्रिया है, जो कंकाल होमियोस्टैसिस के लिए आवश्यक है। ओस्टियोब्लास्ट शिथिलता बिगड़ा हुआ हड्डी के गठन की ओर जाता है और ऑस्टियोपोरोसिस 1,2,3 सहित विभिन्न बीमारियों में परिणाम होता है। अस्थि मज्जा स्ट्रोमल स्टेम कोशिकाओं (बीएमएससी) के पूर्व विवो / इन विट्रो भेदभाव ओस्टियोब्लास्ट अग्रदूतों और परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट के परिणामस्वरूप समय 4,5,6 के साथ संस्कृति पोत में खनिजीकृत हड्डी मैट्रिक्स का गठन और जमाव होता है। ओस्टियोब्लास्ट द्वारा इस हड्डी के गठन के लिए सेलुलर ऊर्जा की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, कोलेजन संश्लेषण और स्राव को सेलुलर एटीपी पर भारी भरोसा करने के लिए दिखाया गया है: एडीपी अनुपात, और संभवतः, खनिजीकृत पुटिका तस्करी और स्राव के लिए अतिरिक्त एटीपी 7,8,9,10,11 की आवश्यकता होती है। कई शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया है कि ओस्टियोब्लास्टोजेनेसिस और ओस्टियोब्लास्ट फ़ंक्शन की प्रक्रिया को हड्डी के गठन की चयापचय मांग को पूरा करने के लिए ऊर्जा की पर्याप्त आपूर्ति की आवश्यकता होती है 12,13,14,15,16। इसलिए, इस विधि का लक्ष्य वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दौरान प्राथमिक, मुरीन स्ट्रोमल कोशिकाओं की बायोएनर्जेटिक स्थिति को चिह्नित करना है। ये तकनीकें कंकाल होमियोस्टैसिस की बेहतर समझ विकसित करने में सहायता करती हैं, जो अंततः कंकाल विकारों में सुधार करने में सक्षम उपन्यास चिकित्सीय विकल्पों के विकास का कारण बन सकती हैं।
वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और लाइव ओस्टियोब्लास्ट्स की बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) को मापने के लिए किया जा सकता है, जो क्रमशः माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक एटीपी उत्पादन से मेल खाता है। इस पद्धति के लिए मौलिक तथ्य यह है कि प्रति लैक्टेट एक एच + आयन लैक्टेट में ग्लूकोज के रूपांतरण में ग्लाइकोलाइसिस के दौरान जारी किया जाता है, जो ईसीएआर मूल्यों में परिलक्षित मीडिया पीएच को बदल देता है। इसके विपरीत, टीसीए (ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड) चक्र के दौरान, माइटोकॉन्ड्रिया के माध्यम से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन ऑक्सीजन का उपयोग या उपभोग करके सीओ2 का उत्पादन करता है, और इसलिए ओसीआर की निगरानी इस चयापचय प्रक्रिया का प्रतिबिंबित करती है। विश्लेषक एक साथ और वास्तविक समय में बाह्य कोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट में ओसीआर और ईसीएआर दोनों को मापता है, जो सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स 6,17 का अध्ययन करते समय जबरदस्त क्षमता की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इन assays प्रदर्शन अपेक्षाकृत सीधा है और आसानी से प्रयोगात्मक लक्ष्य के आधार पर अनुकूलन योग्य है. इसी तरह की तकनीकों को प्रतिरक्षा प्रणाली18,19, कैंसर दीक्षा और प्रगति 20 के टी-सेल चयापचय विनियमन को समझने के लिए नियोजित किया गया है, साथ ही चयापचय सिंड्रोम21,22 में योगदान देने वाले कई अन्य सेल प्रकारों के साथ।
वैकल्पिक तकनीकों पर वास्तविक समय चयापचय फ्लक्स विश्लेषक के फायदों में शामिल हैं (1) वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं के सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को मापने की क्षमता, (2) अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओं के साथ परख करने की क्षमता (5,000 कोशिकाओं के रूप में कम की आवश्यकता होती है), (3) इंजेक्शन पोर्ट समानांतर रूप से एक उच्च-थ्रूपुट 96-वेल सिस्टम में कई उपचारों में हेरफेर करने के लिए, (4) सामान्यीकरण के लिए रेडियोधर्मी लेबल-मुक्त स्वचालित सेल इमेजर का उपयोग18, 23,24. निम्नलिखित विधियों का उद्देश्य विश्लेषक का उपयोग करके ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दौरान मुरीन बीएमएससी में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स की निगरानी का एक सामान्यीकृत लेकिन विस्तृत विवरण प्रदान करना है। इसमें नियमित रूप से किए गए assays शामिल होंगे; हालांकि, कई तकनीकों और तरीकों के साथ, यह अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है कि व्यक्तिगत प्रयोगशालाएं अपने प्रयोगों के लिए विशिष्ट विवरण निर्धारित करती हैं।
परख और assays के विभिन्न प्रकार के उपलब्ध का चयन: परख किट और अभिकर्मकों की एक विस्तृत विविधता कोशिकाओं के bioenergetics का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं, जबकि विश्वसनीयता और प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए. इसके अतिरिक्त, डेस्कटॉप सॉफ़्टवेयर भी परख टेम्पलेट्स प्रदान करता है जिसे आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। परख विभिन्न चयापचय मापदंडों को मापने के लिए उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर परिभाषित किया जा सकता है। इन assays प्रयोगात्मक लक्ष्य और / या वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर विभिन्न तरीकों से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चार इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ, कई यौगिकों को प्रत्येक चयापचय मार्ग के लिए विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए परख मीडिया में इंजेक्ट किया जा सकता है।
सेल ऊर्जा फेनोटाइप परीक्षण: इस परख ‘जीवित कोशिकाओं चयापचय phenotype और चयापचय क्षमता उपायों. इस परख भी पहले कदम के रूप में अनुशंसित करने के लिए मार्ग विशिष्ट चयापचय का एक सामान्यीकृत विचार प्राप्त करने के लिए है. एटीपी सिंथेज़ और कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) के ओलिगोमाइसिन ए-एन अवरोधक का मिश्रण- सेल ऊर्जा क्षमता को समझने के लिए एक माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट इंजेक्ट किया जाता है। ओलिगोमाइसिन ए का इंजेक्शन एटीपी के संश्लेषण को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को अपनी ऊर्जा मांगों को पूरा करने में सक्षम बनाने के लिए ग्लाइकोलाइसिस (ईसीएआर) की दर में वृद्धि होती है; दूसरी ओर, FCCP के इंजेक्शन माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के विध्रुवीकरण के कारण उच्च OCR में परिणाम। अनिवार्य रूप से, यह परख बेसल चयापचय श्वसन को दर्शाता है, और दोहरे इंजेक्शन, धक्का, या तनाव, चयापचय प्रतिक्रिया के बाद। इन मापदंडों के आधार पर, सॉफ़्टवेयर तब कोशिकाओं को एरोबिक, क्विसेंट, ग्लाइकोलाइटिक, या ऊर्जावान राज्य के रूप में वर्गीकृत करके कोशिकाओं के ओसीआर और ईसीएआर को25,26 समय के साथ प्लॉट करता है।
एटीपी वास्तविक समय उत्पादन दर परख: यह ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन से एक साथ सेलुलर एटीपी उत्पादन को मापता है। यह परख मात्रात्मक रूप से दो ऊर्जा मार्गों से चयापचय बदलाव को मापता है और समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक एटीपी उत्पादन दरों पर डेटा प्रदान करता है। परख बेसल OCR और ECAR डेटा प्राप्त करता है, जिसके बाद ओलिगोमाइसिन ए के इंजेक्शन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन दर की गणना की जाती है और रोटेनोन + एंटीमाइसिन ए मिश्रण (माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का कुल निषेध) के इंजेक्शन के माध्यम से ग्लाइकोलाइटिक एटीपी उत्पादन दर की गणना की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल अम्लीकरण17,27 होता है।
सेल माइटोकॉन्ड्रिया तनाव परीक्षण (या सेल माइटो तनाव परीक्षण): यह एटीपी से जुड़े श्वसन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापता है, सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को मापता है, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की पहचान करता है, और तनाव के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को मापता है। बेसल और अतिरिक्त श्वसन क्षमता, एटीपी से जुड़े श्वसन, अधिकतम श्वसन, और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत सहित विभिन्न मापदंडों को एक परख में प्राप्त किया जा सकता है। इस परख oligomycin ए, FCCP (माइटोकॉन्ड्रियल uncoupling एजेंट), rotenone / antimycin एक अवरोधक का मिश्रण के अनुक्रमिक इंजेक्शन शामिल हैं कुशलतापूर्वक माइटोकॉन्ड्रियल समारोह28 पर इन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए.
लचीलापन mito ईंधन फ्लेक्स परीक्षण: यह उनके अवरोधकों की उपस्थिति और अनुपस्थिति द्वारा तीन प्राथमिक माइटोकॉन्ड्रियल ईंधन के ऑक्सीकरण द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापता है। ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और फैटी एसिड का अनुक्रमिक निषेध कोशिकाओं की निर्भरता, क्षमता और लचीलेपन और ऊर्जा की मांग को पूरा करने के लिए विभिन्न सेलुलर मार्गों में कोशिकाओं की निर्भरता को मापने में सहायता करता है। जब माइटोकॉन्ड्रिया अन्य ईंधनों को ऑक्सीकरण करके ब्याज के अवरुद्ध मार्ग की मांगों को पूरा नहीं कर सकता है, तो कोशिकाएं एक निर्भरता स्थिति में प्रवेश करती हैं। कोशिकाओं की क्षमता की गणना अन्य दो वैकल्पिक मार्गों के निषेध द्वारा की जाती है, जिसके बाद ब्याज के मार्ग के निषेध का पालन किया जाता है। कोशिकाओं का लचीलापन माइटोकॉन्ड्रिया की क्षमता को समझने में मदद करता है ताकि वे बाधित मार्ग की ईंधन जरूरतों की भरपाई और पूरा कर सकें। इसकी गणना कोशिकाओं की क्षमता से कोशिकाओं की निर्भरता को घटाकर की जाती है। तीन अलग-अलग अवरोधकों का उपयोग स्वतंत्र रूप से या दो के मिश्रण के रूप में प्रभावी ढंग से परख मापदंडों की गणना करने के लिए किया जाता है। 2-सायनो-3-(1-फिनाइल-1एच-इंडोल-3-yl)-2-प्रोपेनिक एसिड (UK5099) ग्लाइकोलाइसिस में पाइरूवेट वाहक को अवरुद्ध करके ग्लूकोज के ऑक्सीकरण को रोकता है। Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) एथिल सल्फाइड ग्लूटामाइन ऑक्सीकरण मार्ग को रोकता है, और etomoxir लंबी श्रृंखला फैटी एसिड29 के ऑक्सीकरण को रोकता है।
चित्रा 1: विश्लेषण के लिए ओस्टियोब्लास्ट्स को संवर्धित करने और तैयार करने के लिए पद्धति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। मुरीन बीएमएससी को लंबी हड्डियों से अलग किया जाता है, सुसंस्कृत किया जाता है, और 25,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से घनत्व पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों में बीज दिया जाता है। ओस्टियोब्लास्ट विशिष्ट मीडिया में इन कोशिकाओं को संवर्धित करना तब शुरू होता है जब वे अपने भेदभाव को शुरू करने के लिए 80% -100% confluency तक पहुंचते हैं। assays भेदभाव के विभिन्न चरणों में प्रदर्शन कर रहे हैं. कारतूस प्लेटों परख से एक दिन पहले हाइड्रेटेड कर रहे हैं. परख के दिन, विभिन्न inhibitors परख आवश्यकताओं के आधार पर सेंसर कारतूस के बंदरगाहों में इंजेक्ट किया जाता है, और एक अंशांकन बफर 96 अच्छी तरह से अंशांकन प्लेट के लिए जोड़ा जाता है। अंशांकन के बाद, वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स परख किया जाता है, इसके बाद सेल गणना के साथ वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक डेटा को सामान्य करने के लिए माइक्रोप्लेट इमेजर का उपयोग करके सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट को इमेजिंग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में सेलुलर ऊर्जावानों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल BMSCs के कुशल अलगाव को दर्शाता है, उपयुक्त सेल संस्कृति प्लेटो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज (एनआईएएमएस) ग्रांट एआर072123 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए) ग्रांट एजी069795 (ईआरआर) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid | Sigma – Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
| Antimycin A | Sigma – Aldrich | A8674 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
| Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide | Sigma – Aldrich | SML0601 | BPTES |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma – Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 imaging reader | BioTek | N/A | Microplate imager |
| Etomoxir sodium salt hydrate | Sigma – Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| Insulin | Sigma – Aldrich | I6634 | |
| Oleic Acid-Albumin from bovine serum | Sigma – Aldrich | O3008 | |
| Oligomycin A – 5 mg | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Rotenone | Sigma – Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM Glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM media | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent Technologies | S7800B | Real- Time Metabolic flux analyzer |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution |
| The Cell imaging 1.1.0.11 software | Agilent Technologies – BioTek | ||
| Wave software 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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