Använda realtidscellmetabolisk flödesanalysator för att övervaka osteoblastbioenergetik

Summary

Realtidscellmetabolisk flödesanalys mäter syreförbrukningshastigheten och extracellulär försurningshastighet, vilket motsvarar mitokondriell och glykolytisk adenosintrifosfatproduktion, med hjälp av pH- och syresensorer. Manuskriptet förklarar en metod för att förstå osteoblasternas energistatus och karakteriseringen och tolkningen av den cellulära bioenergetiska statusen.

Abstract

Benbildning av osteoblaster är en viktig process för korrekt benförvärv och benomsättning för att upprätthålla skeletthomeostas och i slutändan förhindra fraktur. I intresse för att både optimera toppbenmassan och bekämpa olika muskuloskeletala sjukdomar (dvs. postmenopausal osteoporos, anorexia nervosa, typ 1 och 2 diabetes mellitus) har otroliga ansträngningar gjorts inom benbiologi för att fullt ut karakterisera osteoblaster under hela deras differentieringsprocess. Med tanke på den primära rollen hos mogna osteoblaster för att utsöndra matrisproteiner och mineraliseringsblåsor har det noterats att dessa processer tar en otrolig mängd cellulär energi eller adenosintrifosfat (ATP). Den övergripande cellulära energistatusen kallas ofta cellulär bioenergetik, och den innehåller en serie metaboliska reaktioner som känner av substrattillgänglighet för att härleda ATP för att möta cellulära behov. Därför beskriver den nuvarande metoden processen att isolera primära, murina benmärgsstromalceller (BMSC) och övervaka deras bioenergetiska status med hjälp av realtidscellmetabolisk flödesanalysator i olika stadier i osteoblastdifferentiering. Viktigt är att dessa data har visat att den metaboliska profilen förändras dramatiskt under osteoblastdifferentiering. Således krävs användning av denna fysiologiskt relevanta celltyp för att fullt ut uppskatta hur en cells bioenergetiska status kan reglera den övergripande funktionen.

Introduction

Benbildningen av osteoblasten åtföljs av samordnad förstörelse eller resorption av ben genom osteoklaster. Balansen mellan osteoblastisk benbildning och osteoklastresorption är en kopplad process som beskriver benomsättning eller ombyggnad, vilket är viktigt för skeletthomeostas. Osteoblastdysfunktion leder till nedsatt benbildning och resulterar i olika sjukdomar, inklusive osteoporos ^1,2,3. Ex vivo/in vitro-differentiering av benmärgsstromala stamceller (BMSC) till osteoblastprekursorer och mogna osteoblaster resulterar i bildandet och avsättningen av den mineraliserade benmatrisen i odlingskärlet över tid ^4,5,6. Denna benbildning av osteoblasten kräver en betydande mängd cellulär energi. Specifikt har kollagensyntes och utsöndring visat sig vara starkt beroende av cellulär ATP: ADP-förhållanden, och förmodligen kräver mineraliserad vesikolhandel och utsöndring ytterligare ATP 7,8,9,10,11. Många forskare har visat att processen med osteoblastogenes och osteoblastfunktion kräver en tillräcklig energiförsörjning för att möta den metaboliska efterfrågan på benbildning 12,13,14,15,16. Därför är målet med denna metod att karakterisera den bioenergetiska statusen för primära, murina stromala celler under osteoblastdifferentiering med användning av realtidscellmetabolisk flödesanalysator. Dessa tekniker hjälper till att utveckla en bättre förståelse för skeletthomeostas, vilket i slutändan kan leda till utvecklingen av nya terapeutiska alternativ som kan förbättra skelettsjukdomar.

Realtidscellmetabolisk flödesanalysator kan användas för att mäta syreförbrukningshastigheten (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR) för levande osteoblaster, vilket motsvarar mitokondriell respektive glykolytisk ATP-produktion. Grundläggande för denna metod är det faktum att en H ⁺ -jon per laktat frigörs under glykolys vid omvandling av glukos till laktat, vilket förändrar medias pH som återspeglas i ECAR-värdena. Omvänt, under TCA-cykeln (trikarboxylsyra), producerar oxidativ fosforylering via mitokondrierna CO₂ genom att använda eller konsumera syre, och därför är övervakning av OCR reflekterande av denna metaboliska process. Analysatorn mäter både OCR och ECAR i den extracellulära mikromiljön samtidigt och i realtid, vilket möjliggör enorm potential när man studerar cellulär bioenergetik ^6,17. Dessutom är det relativt enkelt att utföra dessa analyser och lätt anpassningsbart beroende på det experimentella målet. Liknande tekniker har använts för att ytterligare förstå T-cellsmetabolisk reglering av immunsystemet^18,19, cancerinitiering och progression²⁰, tillsammans med flera andra celltyper som bidrar till metaboliska syndrom^21,22.

Fördelarna med metabolisk flödesanalysator i realtid jämfört med alternativa tekniker inkluderar (1) förmågan att mäta cellulär bioenergetik hos levande celler i realtid, (2) förmåga att utföra analys med ett relativt litet antal celler (kräver så lågt som 5 000 celler), (3) injektionsportar för att parallellt manipulera flera behandlingar i ett 96-brunnssystem med hög genomströmning, (4) användning av radioaktiv etikettfri automatiserad cellbildare för normalisering^{18, 23,24}. Följande metoder syftar till att ge en generaliserad men detaljerad beskrivning av övervakning av cellulär bioenergetik i murina BMSC under osteoblastdifferentiering med hjälp av analysatorn. Det kommer att innehålla rutinmässigt utförda analyser; Men som med många tekniker och metoder uppmuntras det starkt att enskilda laboratorier bestämmer specifika detaljer för sina experiment.

Urval av analyser och olika typer av analyser tillgängliga: Ett brett utbud av analyssatser och reagenser finns tillgängliga för att studera cellernas bioenergetik samtidigt som tillförlitligheten och konsistensen av de experimentella resultaten säkerställs. Dessutom erbjuder skrivbordsprogramvaran också analysmallar som enkelt kan anpassas. Analysen kan definieras utifrån användarens behov av att mäta olika metaboliska parametrar. Dessa analyser kan modifieras på olika sätt baserat på det experimentella målet och / eller den vetenskapliga frågan. Till exempel, med fyra injektionsportar, kan flera föreningar injiceras i analysmediet för att analysera det cellulära svaret som är specifikt för varje metabolisk väg.

Cellenergi fenotyp test: Denna analys mäter de levande cellernas metaboliska fenotyp och metaboliska potential. Denna analys rekommenderas också som det första steget för att få en generaliserad uppfattning om vägspecifik metabolism. En blandning av oligomycin A-en-hämmare av ATP-syntas och karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) – ett mitokondriellt frikopplingsmedel injiceras för att förstå cellenergipotentialen. Injektionen av oligomycin A hämmar syntesen av ATP, vilket resulterar i en ökning av glykolyshastigheten (ECAR) för att göra det möjligt för cellerna att uppfylla sina energibehov; å andra sidan resulterar injektionen av FCCP i högre OCR på grund av depolarisering av mitokondriellt membran. I huvudsak visar denna analys basal metabolisk andning, och efter de dubbla injektionerna, tryck eller påfrestningar, det metaboliska svaret. Baserat på dessa parametrar plottar programvaran sedan OCR och ECAR av cellerna genom att klassificera cellerna som aeroba, vilande, glykolytiska eller energiska tillstånd över tiden^25,26.

ATP-analys av produktionshastighet i realtid: Detta mäter den cellulära ATP-produktionen samtidigt från glykolys och mitokondriell andning. Denna analys mäter kvantitativt de metaboliska förändringarna från de två energivägarna och ger data om mitokondriella och glykolytiska ATP-produktionshastigheter över tiden. Analysen erhåller basala OCR- och ECAR-data följt av beräkning av mitokondriell ATP-produktionshastighet genom injektion av oligomycin A och glykolytisk ATP-produktionshastighet genom injektion av rotenon + antimycin A-blandning (total hämning av mitokondriell funktion), vilket resulterar i mitokondriell försurning^17,27.

Stresstest för cellmitokondrier (eller stresstest för cellmito): Detta mäter mitokondriell funktion genom ATP-kopplad andning, kvantifierar cellulär bioenergetik, identifierar mitokondriell dysfunktion och mäter cellernas svar på stress. Olika parametrar, inklusive basal och reserv andningskapacitet, ATP-kopplad andning, maximal andning och icke-mitokondriell syreförbrukning, kan erhållas i en analys. Denna analys innefattar sekventiella injektioner av oligomycin A, FCCP (mitokondriellt frikopplingsmedel), en blandning av rotenon/antimycin A-hämmare för att effektivt analysera effekten av dessa på mitokondriell funktion²⁸.

Flexibilitet mito bränsle flex test: Detta mäter mitokondriell andningshastighet genom oxidation av de tre primära mitokondriella bränslena genom närvaron och frånvaron av deras hämmare. Den sekventiella hämningen av glukos, glutamin och fettsyror hjälper till att mäta cellernas beroende, kapacitet och flexibilitet och cellernas beroende i olika cellulära vägar för att möta energibehovet. När mitokondrierna inte kan uppfylla kraven från den blockerade vägen av intresse genom att oxidera andra bränslen, går cellerna in i ett beroendetillstånd. Cellernas kapacitet beräknas genom hämning av de andra två alternativa vägarna följt av hämning av den intressanta vägen. Cellernas flexibilitet hjälper till att förstå mitokondriernas förmåga att kompensera och möta bränslebehoven hos den hämmade vägen. Det beräknas genom att subtrahera cellernas beroende från cellernas kapacitet. Tre olika hämmare används oberoende eller som en blandning av två för att effektivt beräkna analysparametrarna. 2-cyano-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensyra (UK5099) hämmar oxidationen av glukos genom att blockera pyruvatbäraren vid glykolys. Bis-2-(5-fenylacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-yl) (BPTES) etylsulfid hämmar glutaminoxidationsvägen och etomoxir hämmar oxidationen av långkedjiga fettsyror²⁹.

Figur 1: Schematisk representation av metoden för odling och beredning av osteoblaster för analys. Murina BMSC isoleras från långa ben, odlas och frös i 96-brunnsplattor vid 25 000 celler / brunnsdensitet. Odling av dessa celler i osteoblastspecifika medier startas när de når 80% -100% sammanflöde för att starta sin differentiering. Analyserna utförs i olika stadier av differentiering. Patronplattorna hydreras en dag före analysen. På analysdagen injiceras olika hämmare i portarna på sensorpatronerna baserat på analyskraven, och en kalibreringsbuffert läggs till 96-brunnskalibreringsplattan. Efter kalibrering utförs realtidscellens metaboliska flödesanalys, följt av avbildning av cellodlingsmikroplattan med hjälp av mikroplattbildaren för att normalisera realtidsdata för cellmetaboliska flödesanalysatorer med cellantal. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla förfaranden baserades på riktlinjerna och godkännandet av Institutional Animal Care and Use Committee vid Vanderbilt University Medical Center. 1. Beredning av reagenser och analysuppställning Isolering och odling av benmärgsstromaceller (se även föregående artikel30). Förbered fullständigt alfa minimum essential media (αMEM) cellodlingsmedier genom att komplettera minsta essentiella medier med alfamodifiering med 10% F…

Representative Results

Figur 6: Representativa grafer för rutinmässigt utförda analyser för att förstå den cellulära bioenergetiska profilen för kontroll kontra behandlingsgrupp med deras respektive standardfel. (A) Cellenergifenotyptestet. Diagrammet representerar glykolysen (ECAR) kontra mitokondriell andning (OCR) av kontrollen kontra tv…

Discussion

Realtidscellens metaboliska flödesanalysator kan användas för att utforska cellulär energi under olika förhållanden. Protokollet illustrerar effektiv isolering av BMSC, odlingsceller i lämpliga cellodlingsplattor och deras differentiering till mogna osteoblaster, som kan användas för olika analyser med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn. Vidare förklaras de kritiska stegen i realtid cellmetabolisk flödesanalys, inklusive hydrering av sensorpatroner, laddning av injektionsportarna, utförande av a…

Materials

0.25% Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid	Sigma – Aldrich	PZ0160	UK5099
Antimycin A	Sigma – Aldrich	A8674
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide	Sigma – Aldrich	SML0601	BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma – Aldrich	C2920	FCCP
Cytation 5 imaging reader	BioTek	N/A	Microplate imager
Etomoxir sodium salt hydrate	Sigma – Aldrich	E1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249
Insulin	Sigma – Aldrich	I6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serum	Sigma – Aldrich	O3008
Oligomycin A – 5 mg	Sigma – Aldrich	75351
Rotenone	Sigma – Aldrich	R8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF DMEM media	Agilent Technologies	103575-100	DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent Technologies	S7800B	Real- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 software	Agilent Technologies – BioTek
Wave software 2.6.1	Agilent Technologies
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9422-50G