DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

Summary

ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。

Abstract

循環二色性(CD)分光法は、生体分子の二次構造と相互作用を調べるのに簡単で便利な方法です。CD分光法の最近の進歩により、さまざまな微小環境におけるDNA-タンパク質相互作用と立体構造ダイナミクスの研究が可能になり 、インビボにおける転写調節の理解が深くなっています。転写が起こるためには、転写領域の周囲の領域を巻き戻す必要があります。これは、ヒストン修飾の調整、DNAへの転写因子の結合、および他のクロマチンリモデリング活動を必要とする複雑なプロセスである。CD分光法を用いて、ATP依存クロマチンリモデル剤などの調節タンパク質によって引き起こされるプロモーター領域における立体構造変化を研究し、転写を促進することができる。タンパク質に生じる立体構造変化もモニターできる。また、標的DNAに対するタンパク質の親和性や配列特異性に関する問い合わせは、標的DNAに変異を組み込むことによって対処することができる。要するに、この敏感で安価な方法のユニークな理解は、クロマチンダイナミクスの変化を予測することができ、それによって転写調節の理解を改善する。

Introduction

円二色性(CD)は、右利きと左利きの円偏光の差動吸収につながる生体高分子の固有のキラリティに依存する分光技術です。この差動吸収は、円形のジクロリズムとして知られています。したがって、この技術は、キラル^{センター1,2}を含むタンパク質およびDNAなどの生物学的高分子の立体構造を表現するために使用することができる。

電磁波には、電気と磁気の両方のコンポーネントが含まれています。電気と磁界は、波の伝播方向に対して垂直に振動します。偏光のない光の場合、これらのフィールドは多くの方向に振動します。光が円偏光すると、互いに90°位相差で2つの電磁場が得られます。キラル分子は、右利きの円偏光と左利きの円偏光を異なる範囲に吸収するような円状の光学回転(複屈折)を示す³。得られた電界は、波長の関数である楕円としてトレースされます。このCDスペクトルは、このように、楕円度(q)として記録され、データは波長の関数として平均残基楕円度として提示される。

タンパク質の場合、アミノ酸のCα(グリシンを除く)はキラルであり、これはCD分光法によって利用され、この高分子⁴の二次構造を決定する。タンパク質分子のCDスペクトルは、通常、遠紫外線範囲で記録されます。αヘリカルタンパク質は、222 nmおよび208 nmで2つの陰性バンドを有し、193 ^nm4で1つの正のピークを有する。抗平行βシート二次構造を有するタンパク質は、218 nmで負のピークを示し、195 ^nm4で正のピークを示す。無秩序な構造を有するタンパク質は、210 nm付近の低い楕円性と195 ^nm4で負のピークを示す。したがって、異なる二次構造の明確なピーク/バンドは、CDを作る変性とリガンド結合の間にタンパク質の二次構造に起こる構造変化を解明するための便利なツールです。

核酸には、糖分子、二次構造のヘリシティ、および環境中のDNAの長期三次配列の3つの源があります^5,6。核酸のCDスペクトルは、典型的には190〜300 nm範囲^5,6で記録^される。DNAの各立体構造は、タンパク質と同様に特徴的なスペクトルを与えますが、ピーク/バンドは溶媒条件とDNA配列の違いのためにある程度変化する可能性があります⁷。最も一般的な形態であるB-DNAは、260〜280 nm前後の陽性ピークと245 ^nm6の周りの陰性ピークによって特徴付けられる。B型DNAのピーク/バンドは、塩基対が二重らせんに垂直であるため、一般的に小さく、分子に弱いキラリティを与える。A-DNAは260 nmで優勢な陽性ピークを与え、210 ^nm6の周りに陰性のピークを与える。左利きのらせんであるZ-DNAは、290nmで陰性バンドを与え、260 ^nm6の周りに正のピークを与える。このDNAはまた、205 ^nm6で非常に陰性のピークを与える。

これらの立体構造に加えて、DNAはトリプレックス、四重プレックス、ヘアピンを形成することができ、そのすべてがCD分光法によって区別することができる。並列G-quadruplexは260nmで優勢な正のバンドを与え、反平行G-quadruplexは260 nmで負のバンドを与え、290 nmで正のピークを与え、2つの形態の四重プレックス構造⁶を区別することを容易にする。トリプレックスは特徴的^{なスペクトル8}を与えない。例えば、Na⁺ 存在下でG.G.CとT.A.T塩基対を含む分子内三重らせんを形成する可能性のある36ヌクレオチド長DNAのスペクトルは、240nmで強い陰性バンドを示し、広い陽性ピークを示す。広い正のピークは266、273、および286 nmの貢献を示す。Na⁺ およびZn⁺ の存在下での同じオリゴヌクレオチドは、4つの陰性バンド(213、238、266、および282 nm)および258nmで陽性のピークを示す。したがって、トリプレックスDNAのスペクトルは、塩条件に応じて変化する^{可能性がある8}。

これらの立体構造に加えて、CDスペクトルはX-DNAと呼ばれる別の形態のDNAの同定を可能にした。X-DNAは、DNA配列に代替アデニンおよびチミン残基が含まれるときに形成される。X-DNAのCDスペクトルは250および280 nmの2つの陰性ピークを含んでいる。X-DNAに関する情報はほとんどないが、陽性スーパーコイル^6,9のシンクとして^{機能すると推測}されている。CDスペクトルの変化はまた、リガンドとタンパク質相互作用に関する詳細を明らかにすることができ、したがって、薬物タンパク質相互作用を検出するための分子方法の武器庫に追加された^{10、11、12、13、14}。CDスペクトルは、折り畳みプロセス¹⁵中のタンパク質の二次構造の変化を監視するためにも使用されてきた。同様に、CDスペクトルは、リガンドとDNA相互作用の調査にも使用できる^16,17。

CD分光法は、このように、DNAの構造の異なる形態を区別する容易で安価な方法であり、それほど安価ではない機器およびソフトウェアへのアクセスがある場合である。この方法は非常に敏感で迅速です。少量のDNAしか必要としないため、核磁気共鳴(NMR)分光法の代替技術に優位性を与えます。リガンドや基質を用いた滴定も容易に行えます。主な制約は、DNAが非常に純粋でなければならないということです。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)精製DNAを使用することをお勧めします。

CDスペクトルによって得られた情報は、主にタンパク質の構造特徴を推測し、明確なDNA適合体を同定するために使用されてきました。本研究では、イン ビボ クロマチン免疫沈降(ChIP)実験から得られた結果を統合し、目的のタンパク質/予測転写因子がそのエフェクター遺伝子のプロモーター領域に立体構造変化をもたらすかどうかを示すために使用されています。このコラボレーションは、プロモーターの転写開始部位(TSS)とその周辺で予測された転写因子による転写調節機構を予測することにより、従来のCD分光技術の進行を助ける。

クロマチンリモデリングは、密に詰まったクロマチンを転写因子、DNA複製の構成要素、損傷修復タンパク質などの様々な調節因子にアクセスできるようにすることで、DNA代謝プロセスを調節することが知られている明確なメカニズムです。ATP依存クロマチンリモデル剤は、SWI/SNFファミリーのタンパク質とも呼ばれ、真核細胞に存在する主要なリモデルタンパク質^{である18,19です}。系統的クラスタリングは、SWI/SNFファミリーのタンパク質を6つのサブグループ²⁰に分類しました:Snf2のような、Swr1のような、SSO1653のような、Rad54のような、Rad5/16のような、そして遠く離れています。本研究で関心のあるタンパク質であるSMARCAL1は、遠方のサブグループ²⁰に属する。このタンパク質は、CD分光法を用いた転写調節の様式を調べるのに用いられている。

ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質のメンバーのほとんどは、核酸を再位置または除去するか、またはATP依存的な様式でヒストン変異体交換を媒介することが示されている^21,22。しかし、このファミリーの一部のメンバーは、例えばSMARCAL1のヌクレオソームを改造することが示されていない。SMARCAL1がポリテネ染色体と関連することが研究で示されているにもかかわらず、ヌクレオソームを改造する能力に関する実験的証拠は欠けている^23。そこで、SMARCAL1は^DNA24の立体構造を変化させることによって転写を調節する可能性があると仮定した。CD分光法は、この仮説を検証するための簡単でアクセス可能な方法を提供した。

SMARCAL1は、主にアニーリングヘリカーゼ^25,26,27として機能するATP依存クロマチンリモデリングタンパク質^です。DNAコンフォメーション²⁴を改造して転写を変調するように仮定されている。この仮説を検証するために、ドキソルビシン誘発DNA損傷時の遺伝子転写を調節するSMARCAL1の役割を検討した。これらの研究では、SMARCAL1はインビボ分析とADAADのインビトロアッセイ^28,29に使用されました。これまでの研究では、ADAADは構造に依存するが配列に依存しない方法でDNAを認識できることが示されています^30,31。このタンパク質は、ステムループDNAと同様に、二本鎖を有するDNA分子と一本鎖転移領域に最適に結合し、ATP ^30,31を加水分解する。

インビボ実験は、SMARCAL1がプロモーター領域^28,29に結合することによってMYC、DROSHA、DGCR8およびDICERの発現を調節することを示した。相互作用の領域は、ChIP実験^28,29によって同定された。ChIP技術は、細胞内の同一DNAとタンパク質の相互作用を分析するために使用されます。その目標は、プロモーターまたは他のDNA結合部位上の転写因子などの特定のタンパク質が特定のゲノム領域に結合しているかどうかを判断することです。DNAに結合したタンパク質は、ホルムアルデヒドを用いて最初に架橋される。その後、クロマチンの単離が続きます。分離されたクロマチンは、超音波処理またはヌクレアーゼ消化のいずれかによって500bp断片に切断され、DNAに結合したタンパク質は、タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降する。架橋は逆転し、DNAはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量的リアルタイムPCRを用いて分析されます。

ChIPの結果は、SMARCAL1がこれらの遺伝子のプロモーター領域の立体構造変化を誘導することによって転写調節を媒介する可能性があるという仮説につながった。QGRSマッパーおよびMfoldソフトウェアは、これらのプロモーター領域が二次構造を形成する可能性を同定するために使用された^28,29。QGRSマッパーはG-quadruplexes32の予測に使用され、^Mfold33はステムループなどの二次構造を形成するシーケンスの能力を分析します。

二次構造解析の後、さらにインビトロ実験を組換え6X Hisタグ付き活性DNA依存ATPase Aドメイン(ADAAD)、SMARCAL1のウシホモログ、大腸菌から精製したATPaseアッセイは、同定されたDNA配列がエフェク^ター28,29として作用し得ることを確立するためにADAADを用いて行った。最後に、^ADAAD28,29によってDNA分子に誘導された立体構造変化をモニターするためにCD分光法を行^った。

タンパク質のATPase活性がDNA分子の立体構造変化を誘導するために不可欠であることを証明するために、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)をキレートMg⁺²または活性DNA依存ATPase Aドメイン阻害剤ネオマイシン(ADAADiN)^{に添加した}。.このCD分光技術は、プロモーターの予測ゲノム領域に結合するために、ChIPまたは他の任意の関連アッセイによって実証された任意の精製タンパク質と利用することができる。

Protocol

1. 反応成分の働き濃度 CDやその他の反応成分のバッファーの作業濃度を新たに準備し( 表1参照)、4°Cに保ってから反応を設定します。注:この論文に記載されているCD反応の場合、成分の働く濃度は次のとおりです: リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, プロテイン 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM. 2. ATPa…

Representative Results

ADAADは、MYCプロモーター上の構造のようなステムループを安定化させる これまでの実験的証拠は、SMARCAL1がMYC29の陰性調節因子であることを示した。QGRSマッパーによるMYC遺伝子の159bp長いプロモーター領域の分析は、前方鎖がG-quadruplexを形成する可能性を有することを示した(表2)。Mfoldは、MYC DNA…

Discussion

本稿の目的は、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質の存在下でDNAに生じる立体構造変化を研究し、これらの構造変化を遺伝子発現に結びつける手法としてCD分光法を紹介することにある。CD分光法は、DNAの立体構造変化を研究するための迅速かつ容易にアクセス可能な方法を提供します。

この技術に考慮されるべき重要なポイントは、DNAとタンパク質の純度?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500