CD-спектроскопия для изучения взаимодействий ДНК и белка

Summary

Взаимодействие АТФ-зависимого ремоделятора хроматина с лигандом ДНК описано с помощью CD-спектроскопии. Индуцированные конформационные изменения на промоторе гена, проанализированные генерируемыми пиками, могут быть использованы для понимания механизма транскрипционной регуляции.

Abstract

Круговая дихроизмная (CD) спектроскопия является простым и удобным методом исследования вторичной структуры и взаимодействий биомолекул. Последние достижения в области CD-спектроскопии позволили детально изучить днк-белковые взаимодействия и конформационную динамику ДНК в различных микросредах для лучшего понимания транскрипционной регуляции in vivo. Область вокруг потенциальной зоны транскрипции должна быть размотана для того, чтобы произошла транскрипция. Это сложный процесс, требующий координации модификаций гистонов, связывания транскрипционного фактора с ДНК и других действий по ремоделированию хроматина. Используя CD-спектроскопию, можно изучать конформационные изменения в промоторной области, вызванные регуляторными белками, такими как АТФ-зависимые ремоделирующие хроматины, для стимулирования транскрипции. Конформационные изменения, происходящие в белке, также можно контролировать. Кроме того, вопросы, касающиеся сродства белка к его целевой ДНК и специфичности последовательности, могут быть решены путем включения мутаций в целевую ДНК. Короче говоря, уникальное понимание этого чувствительного и недорогого метода может предсказать изменения в динамике хроматина, тем самым улучшая понимание транскрипционной регуляции.

Introduction

Круговой дихроизм (CD) – это спектроскопическая техника, которая опирается на присущую биологическим макромолекулам хиральность, что приводит к дифференциальному поглощению правостороннего и левостороннего циркулярно поляризованного света. Это дифференциальное поглощение известно как круговой дихроизм. Таким образом, этот метод может быть использован для очерчивания конформации биологических макромолекул, таких как белки и ДНК, оба из которых содержат хиральные ^{центры1,2}.

Электромагнитные волны содержат как электрические, так и магнитные компоненты. Как электрическое, так и магнитное поля колеблются перпендикулярно направлению распространения волны. В случае неполяризованного света эти поля колеблются во многих направлениях. Когда свет циркулярно поляризован, два электромагнитных поля получаются при разности фаз 90° друг к другу. Хиральные молекулы демонстрируют круговое оптическое вращение (двулучепреломление) таким образом, что они будут поглощать правосторонний циркулярно поляризованный свет и левосторонний циркулярно поляризованный свет в разной ^{степени3}. Полученное электрическое поле будет прослежено в виде эллипса, функции длины волны. Таким образом, спектр CD регистрируется как эллиптичность (q), а данные представляются как средняя эллиптичность остатка как функция длины волны.

В случае белков Cα аминокислот (кроме глицина) является хиральным, и это используется CD-спектроскопией для определения вторичной структуры этой ^{макромолекулы4}. СПЕКТРЫ CD белковых молекул обычно регистрируются в дальнем УФ-диапазоне. α-спиральные белки имеют две отрицательные полосы при 222 нм и 208 нм и один положительный пик при 193 ^нм4. Белки с антипараллельной β листовой вторичной структурой показывают отрицательный пик при 218 нм и положительный пик при 195 ^нм4. Белки с неупорядоченной структурой показывают низкую эллиптичность около 210 нм и отрицательный пик в 195 ^нм4. Таким образом, четко определенные пики/полосы для различных вторичных структур делают CD удобным инструментом для выяснения конформационных изменений, происходящих во вторичной структуре белков во время денатурации, а также связывания лигандов.

Нуклеиновые кислоты имеют три источника хиральности: молекулу сахара, спиральность вторичной структуры и дальнодействующее третичное упорядочение ДНК в окружающей ^{среде5,6}. СПЕКТРЫ CD нуклеиновых кислот обычно регистрируются в диапазоне от 190 до 300 ^нм5,6. Каждая конформация ДНК, как и белки, дает характерный спектр, хотя пики/полосы могут варьироваться в некоторой степени из-за условий растворителя и различий в последовательностях ^ДНК7. B-ДНК, наиболее распространенная форма, характеризуется положительным пиком около 260-280 нм и отрицательным пиком около 245 ^нм6. Пики/полосы В-формы ДНК, как правило, малы, потому что пары оснований перпендикулярны двойной спирали, придавая молекуле слабую хиральность. A-ДНК дает доминирующий положительный пик при 260 нм и отрицательный пик около 210 ^нм6. Z-ДНК, левая спираль, дает отрицательную полосу при 290 нм и положительный пик около 260 ^нм6. Эта ДНК также дает крайне отрицательный пик в 205 ^нм6.

В дополнение к этим конформациям ДНК также может образовывать триплексы, квадруплексы и шпильки, все из которых можно отличить с помощью CD-спектроскопии. Параллельный G-квадруплекс дает доминирующую положительную полосу при 260 нм, в то время как антипараллельный G-квадруплекс дает отрицательную полосу при 260 нм и положительный пик при 290 нм, что позволяет легко различать две формы квадруплексных ^{структур6}. Триплексы не дают характеристического ^{спектра8}. Например, спектры 36-нуклеотидной ДНК с потенциалом формирования внутримолекулярной тройной спирали, содержащей пары оснований G.G.C и T.A.T. в присутствии Na⁺ показывают сильную отрицательную полосу при 240 нм и широкий положительный пик. Широкий положительный пик показывает вклад в 266, 273 и 286 нм. Тот же олигонуклеотид в присутствии Na⁺ и Zn⁺ показывает четыре отрицательные полосы (213, 238, 266 и 282 нм) и положительный пик на 258 нм. Таким образом, спектры триплексной ДНК могут варьироваться в зависимости от солевых ^{условий8}.

В дополнение к этим конформациям, спектры CD позволили идентифицировать другую форму ДНК, называемую X-ДНК. X-ДНК образуется, когда последовательность ДНК содержит альтернативные остатки аденина и тимина. CD-спектры X-ДНК содержат два отрицательных пика при 250 и 280 нм. Очень мало информации о X-ДНК, хотя было высказано предположение, что она функционирует как поглотитель для положительной ^{суперспирали6,9}. Изменения в спектрах CD также могут раскрывать подробности о лиганд-белковых взаимодействиях и, следовательно, были добавлены в арсенал молекулярных методов обнаружения лекарственно-белковых взаимодействий10,11,12,13,14. Спектры CD также использовались для мониторинга изменений вторичной структуры белков в процессе сворачивания15. Аналогичным образом, спектры CD также могут быть использованы для зондирования взаимодействия лиганд-ДНК16,17.

Таким образом, CD-спектроскопия является простым и недорогим методом различения различных форм конформации ДНК при условии доступа к не очень недорогому оборудованию и программному обеспечению. Метод чрезвычайно чувствителен и быстр. Он требует только небольшого количества ДНК, что дает ему преимущество перед альтернативным методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Титрование лигандами и субстратами также легко выполнить. Основным ограничением является то, что ДНК должна быть очень чистой. Целесообразно использовать полиакриламидный гель электрофорез (PAGE) – очищенную ДНК.

Информация, полученная с помощью спектров CD, в основном использовалась для определения структурных особенностей белка и идентификации различных конформеров ДНК. В этом исследовании спектры CD были использованы для интеграции результатов, полученных в результате эксперимента in vivo с иммунопреципитацией хроматина (ChIP), чтобы определить, может ли интересующий белок / прогнозируемый фактор транскрипции вызвать конформационные изменения в промоторной области его эффекторных генов. Это сотрудничество помогает в прогрессе традиционных спектроскопических методов CD, предсказывая механизм регуляции транскрипции предсказанным фактором транскрипции на и вокруг сайта начала транскрипции (TSS) промотора.

Ремоделирование хроматина является четко определенным механизмом, который, как известно, регулирует метаболические процессы ДНК, делая плотно упакованный хроматин доступным для различных регуляторных факторов, таких как факторы транскрипции, компоненты репликации ДНК или белки восстановления повреждений. АТФ-зависимые ремоделирующие хроматины, также известные как семейство белков SWI/SNF, являются ключевыми белками-ремоделирующими, присутствующими в эукариотических ^{клетках18,19}. Филогенетическая кластеризация классифицировала семейство белков SWI/SNF на 6 ^{подгрупп20}: Snf2-подобные, Swr1-подобные, SSO1653-подобные, Rad54-подобные, Rad5/16-подобные и отдаленные. SMARCAL1, белок, представляющий интерес в данном исследовании, относится к отдаленной ^{подгруппе20}. Этот белок был использован для исследования его способа транскрипционной регуляции с использованием CD-спектроскопии.

Было показано, что большинство членов АТФ-зависимых белков ремоделирования хроматина либо репозиционируют, либо вытесняют нуклеосомы, либо опосредуют обмен вариантами гистонов АТФ-зависимым ^{способом21,22}. Тем не менее, некоторые члены этого семейства не были показаны для ремоделирования нуклеосом, например, SMARCAL1. Несмотря на то, что исследования показали, что SMARCAL1 ассоциируется с политеновыми хромосомами, экспериментальные данные относительно его способности ремоделировать нуклеосомы ^{отсутствуют23}. Поэтому было постулировано, что SMARCAL1 может регулировать транскрипцию, изменяя конформацию ^ДНК24. CD-спектроскопия обеспечила простой и доступный метод для подтверждения этой гипотезы.

SMARCAL1 является АТФ-зависимым хроматиновым ремоделирующим белком, который в основном функционирует как геликаза отжига25,26,27. Было постулировано модулировать транскрипцию путем ремоделирования конформации ^ДНК24. Чтобы проверить эту гипотезу, была изучена роль SMARCAL1 в регуляции транскрипции генов во время повреждения ДНК, индуцированного доксорубицином. В этих исследованиях SMARCAL1 использовался для анализа in vivo и ADAAD для анализов in vitro28,29. Предыдущие исследования показали, что ADAAD может распознавать ДНК структурно-зависимым, но независимым от последовательностей ^{способом30,31}. Белок оптимально связывается с молекулами ДНК, обладающими двухцепочечными к одноцепочечным переходным областям, похожим на стволовую петлю ДНК, и гидролизует АТФ ^30,31.

Эксперименты in vivo показали, что SMARCAL1 регулирует экспрессию MYC, DROSHA, DGCR8 и DICER путем связывания с промоторными областями28,29. Область взаимодействия была идентифицирована экспериментами ^ChIP28,29. Метод ChIP используется для анализа взаимодействия белка с его родственной ДНК внутри клетки. Его цель состоит в том, чтобы определить, связаны ли специфические белки, такие как факторы транскрипции на промоторах или других сайтах связывания ДНК, с конкретными геномными областями. Белок, связанный с ДНК, сначала сшивается с использованием формальдегида. За этим следует выделение хроматина. Изолированный хроматин сдвигается до 500 фрагментов bp либо путем обработки ультразвуком, либо путем переваривания нуклеазы, а белок, связанный с ДНК, иммунопреципитируется с использованием антител, специфичных для белка. Сшивка обратная, и ДНК анализируется с использованием либо полимеразной цепной реакции (ПЦР), либо количественной ПЦР в реальном времени.

Результаты ChIP привели к гипотезе о том, что SMARCAL1, возможно, опосредует транскрипционную регуляцию, вызывая конформационные изменения в промоторных областях этих генов. Программное обеспечение QGRS mapper и Mfold использовались для определения потенциала этих промоторных регионов для формирования вторичных ^{структур28,29}. QGRS mapper используется для прогнозирования G-квадруплексов32, в то время как ^Mfold33 анализирует способность последовательности формировать вторичные структуры, такие как стволовые петли.

После вторичного структурного анализа дальнейшие эксперименты in vitro были проведены с рекомбинантным 6X His-меченым активным ДНК-зависимым доменом АТФазы А (ADAAD), бычьим гомологом SMARCAL1, очищенным от Escherichia coli34. Анализы АТФазы были выполнены с использованием ADAAD, чтобы установить, что идентифицированные последовательности ДНК могут действовать как ^{эффекторы28,29}. Наконец, CD-спектроскопия была выполнена для мониторинга конформационных изменений, индуцированных в молекуле ДНК ^ADAAD28,29.

Чтобы доказать, что атфазная активность белка была необходима для индуцирования конформационного изменения в молекуле ДНК, к хелату Mg⁺² добавляли либо тетрауксусную кислоту этилендиамина (ЭДТА), либо добавляли активный ДНК-зависимый ингибитор домена АТФазы А Неомицин (ADAADiN), специфический ингибитор белка SWI/^SNF35,36 . Этот метод CD-спектроскопии может быть использован с любым очищенным белком, который был продемонстрирован ChIP или любым другим соответствующим анализом для связывания с прогнозируемой геномной областью промотора.

Protocol

1. Рабочая концентрация реакционных компонентов Подготовьте рабочие концентрации буферов для CD и других реакционных компонентов в свежем виде (см. Таблицу 1) и сохраните их при 4 °C перед началом реакций.ПРИМЕЧАНИЕ: Для РЕАКЦИЙ CD, описанных в настоящей статье, ра?…

Representative Results

ADAAD стабилизирует структуру, похожую на стволовую петлю, на промоутере MYCПредыдущие экспериментальные данные показали, что SMARCAL1 является отрицательным регулятором MYC29. Анализ промоторной области гена MYC длиной 159 bp показал, что п…

Discussion

Целью данной статьи является внедрение метода CD-спектроскопии как подхода к изучению конформационных изменений, происходящих в ДНК в присутствии АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих белков, и связывание этих конформационных изменений с экспрессией генов. CD-спектроскопия обеспечив?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500