אקס ויוו זלוף כבד דרך וריד הפורטל בעכבר
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה פשוטה לכריתת כבד עכבר שלם למחקרים מטבוליים באמצעות זלוף ורידים פורטלי.
Abstract
מחלות מטבוליות כגון סוכרת, טרום סוכרת, מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית (NAFLD) וסטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) הופכות נפוצות יותר ויותר. פרפוזיות כבד Ex vivo מאפשרות ניתוח מקיף של חילוף החומרים בכבד באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR), בתנאים תזונתיים שניתן לשלוט בהם בקפדנות. מכיוון שבסימולציות סיליקו נותרות אמצעי תיאורטי בעיקר להערכת פעולות הורמונים וההשפעות של התערבות תרופתית, הכבד החדור נותר אחת ממיטות הבדיקה החשובות ביותר להבנת חילוף החומרים בכבד. מכיוון שמחקרים אלה מנחים תובנות בסיסיות על פיזיולוגיה של הכבד, התוצאות חייבות להיות מדויקות וניתנות לשחזור. הגורם הגדול ביותר בשכפול של זלוף כבד ex vivo הוא איכות הניתוח. לכן, הצגנו שיטה מאורגנת ויעילה לביצוע זלופיות כבד של עכברי ex vivo בהקשר של ניסויי NMR באתרם . כמו כן, אנו מתארים יישום ייחודי ודנים בסוגיות נפוצות בהן נתקלנו במחקרים אלה. המטרה הכוללת היא לספק מדריך לא מסובך לטכניקה ששכללנו במשך מספר שנים שאנו רואים בה את תקן הזהב להשגת תוצאות הניתנות לשחזור בניתוחים בכבד ובעיבויים בהקשר של ניסויי NMR באתרם . המרחק למרכז השדה של המגנט, כמו גם חוסר הנגישות של הרקמה להתערבות במהלך ניסוי NMR, הופכים את השיטות שלנו לרדומות.
Introduction
זלוף Ex vivo הוא חיוני בחקר חילוף החומרים בכבד, וזלוף דרך וריד הפורטל הוא הסטנדרט למחקרים אלה. על מנת לחקור את חילוף החומרים בכבד בבידוד, יש לכרות את הכבד מהגוף כדי למנוע סיבוכים הנובעים מחילוף חומרים באיברים אחרים (כלומר, חילוף חומרים בכל הגוף) ולהפעיל שליטה על זמינות ההורמונים (אינסולין, גלוקגון וכו ‘). גישה זו יכולה להיות חיונית להבנת ההשפעות של מחלות כגון סוכרת, NAFLD ו- NASH על חילוף החומרים בכבד, כמו גם מנגנונים של פעולה תרופתית. מאמר זה משמש כמדריך לכריתה וזליעה של הכבד. פיתחנו הליך יעיל לביצוע מחקרי כבד מטבוליים אלה בקפדנות ובשכפול מספיקים. אם הניתוח אינו מבוצע כראוי, יש שונות בולטת בנתונים המטבוליים המתקבלים. אנו מתארים שיטה מאורגנת לביצוע צנתור ורידים פורטליים וכריתת כבד בהקשר של מחקרים מטבוליים באתרם בספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כמתואר בספרות 1,2,3,4,5.
נכון לעכשיו, אין ספרות המתארת פרפוזיה של כבד ex vivo באמצעות עמוד זכוכית בתוך NMR. כמו כן, אין סרטון או פרסום טקסט המספק דוגמה ברורה כיצד לבצע את ההליך עם כבד העכבר, במיוחד, המדגים כיצד לצנתר את וריד הפורטל, לכרות כבד, להעביר ולתלות את הכבד על עמוד זכוכית. מכיוון שהעכבר המהונדס גנטית משמש בכל מקום לחקר חילוף החומרים בכבד, זהו הליך חיוני הראוי לתיאור מלא. ניתוחי זלוף בכבד אינם חדשים, אך מאמר זה הוא שיטת תקן זהב המלווה בסרטון המדגים את המצוינות הטכנית המתוארת במאמר זה כדי לסייע לכל מי שמעוניין בהליך זה. השיטה המוצגת כאן תיושם בצורה הטובה ביותר על חילוף חומרים בזמן אמת כדי לזהות את התפקוד והמחזור של מטבוליטים במודלים של מחלות.
שיטה זו משתמשת בעמוד זכוכית מצופה מים בקוטר 100 ס”מ, המאפשר לכבד להיתלות בתחתית הצינורית עטופה על ידי תפרחת בתוך צינור NMR. מים מחוממים במעיל הזכוכית משמשים לשליטה בטמפרטורה המחלחלת. מחמצן שכבה דקה בלחץ עם 95%/5% O2/CO2 לשליטה ב-pH. על ידי שימוש בשלוש משאבות נפרדות, נקבע גובה העמוד המחורץ, המספק לחץ מתמיד לכבד. קצבי הזרימה אינם נשלטים מעבר ליישום של לחץ קבוע (איור 1). כדי לוודא שהכבד מתפקד כראוי, מדידות חמצן נלקחות יחד עם קצבי זרימה. בידינו, קבוצה זו של תנאים מוקדמים מובילה לניסויי NMR הניתנים לחזרה חוזרת על עצמה להערכת התפקוד המטבולי של הכבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך כירורגי זה הוא מאתגר ודורש תרגול נרחב כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. יש להתאים את איזופלורן וגז המוביל לפי הצורך כדי לשמור על הכדאיות של החיה במהלך כמה שיותר מההליך הכירורגי. סביבה, שעה ביום, גיל, משקל ומספר גורמים נוספים ישפיעו על ההרדמה. משקל, תזונה, זן של עכברים וגיל עשויים להשפיע ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון של המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). חלק מעבודה זו בוצע במכון המוח של מק’נייט במתקן ההדמיה והספקטרוסקופיה המתקדמת של תהודה מגנטית (AMRIS) של המעבדה הלאומית לשדה מגנטי גבוה, הנתמך על ידי הסכם שיתוף הפעולה מס’ של הקרן הלאומית למדע. DMR-1644779 ומדינת פלורידה.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
