एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण
Summary
बैक्टीरिया बायोएक्टिव जैविक अणुओं को ले जाने वाले नैनोमीटर आकार के बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का स्राव करते हैं। ईवी अनुसंधान उनके बायोजेनेसिस, माइक्रोब-माइक्रोब और होस्ट-माइक्रोब इंटरैक्शन और बीमारी में भूमिका, साथ ही साथ उनके संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों को समझने पर केंद्रित है। ईवी अनुसंधान के मानकीकरण की सुविधा के लिए विभिन्न बैक्टीरिया से ईवी के स्केलेबल अलगाव के लिए एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
विविध जीवाणु प्रजातियां ~ 20-300 एनएम बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का स्राव करती हैं, जिसमें लिपिड, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, ग्लाइकेन्स और माता-पिता की कोशिकाओं से प्राप्त अन्य अणु शामिल होते हैं। ईवी संक्रमण और उपनिवेशीकरण के संदर्भ में बैक्टीरिया और मेजबान जीवों के बीच बातचीत में योगदान देते हुए इंट्रा-और इंटर-प्रजाति संचार वैक्टर के रूप में कार्य करते हैं। स्वास्थ्य और बीमारी में ईवी के लिए जिम्मेदार कार्यों की भीड़ को देखते हुए, इन विट्रो और विवो अध्ययनों में ईवी को अलग करने में रुचि बढ़ रही है। यह अनुमान लगाया गया था कि भौतिक गुणों, अर्थात् आकार के आधार पर ईवी का पृथक्करण, विभिन्न जीवाणु संस्कृतियों से पुटिकाओं के अलगाव की सुविधा प्रदान करेगा।
आइसोलेशन वर्कफ़्लो में बैक्टीरियल संस्कृतियों से ईवी के अलगाव के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) शामिल हैं। स्केलेबिलिटी को बढ़ाने के लिए एक पंप-संचालित स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) चरण को शामिल किया गया था, जिससे सेल संस्कृति शुरू करने वाले लीटर से सामग्री का अलगाव सक्षम हो सके। एस्चेरिचिया कोलाई का उपयोग एक मॉडल प्रणाली के रूप में किया गया था जो ईवी से जुड़े नैनोलुसीफेरेज़ और गैर-ईवी-संबद्ध एमचेरी को रिपोर्टर प्रोटीन के रूप में व्यक्त करता था। नैनोलुसीफेरस को साइटोलिसिन ए के साथ अपने एन-टर्मिनस को फ्यूज करके ईवी को लक्षित किया गया था। प्रारंभिक क्रोमैटोग्राफी अंश जिसमें 20-100 एनएम ईवी होते हैं, जिनमें संबंधित साइटोलिसिन ए – नैनोलुक होते हैं, मुक्त प्रोटीन वाले बाद के अंशों से अलग थे। ईवी से जुड़े नैनोलुसीफेरेज़ की उपस्थिति की पुष्टि इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। यह ईवी अलगाव वर्कफ़्लो अन्य मानव आंत से जुड़े ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु प्रजातियों पर लागू होता है। अंत में, सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन / टीएफएफ और एसईसी के संयोजन से विभिन्न जीवाणु प्रजातियों से ईवी के स्केलेबल अलगाव को सक्षम बनाया जाता है। एक मानकीकृत अलगाव वर्कफ़्लो को नियोजित करने से प्रजातियों में माइक्रोबियल ईवी के तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा होगी।
Introduction
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) नैनोमीटर के आकार की, लिपोसोम जैसी संरचनाएं होती हैं जिनमें लिपिड, प्रोटीन, ग्लाइकेन्स और न्यूक्लिक एसिड होते हैं, जो प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिककोशिकाओं दोनों द्वारा स्रावित होते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया2 से ईवी की रिहाई की कल्पना करने वाले शुरुआती अध्ययनों के बाद से, बैक्टीरियल ईवी (व्यास में 20-300 एनएम) के लिए जिम्मेदार जैविक कार्यों की संख्या पिछले दशकों में लगातार बढ़ रही है। उनके कार्यों में एंटीबायोटिक प्रतिरोध3, बायोफिल्म गठन4, कोरम सेंसिंग5 और विष वितरण 6 को स्थानांतरित करना शामिलहै। चिकित्सीय के रूप में बैक्टीरियल ईवी के उपयोग में भी रुचि बढ़ रही है, विशेष रूप से वैक्सीनोलॉजी7 और कैंसर थेरेपी8 में।
ईवी अनुसंधान में बढ़ती रुचि के बावजूद, अलगाव के तरीकों के बारे में अभी भी तकनीकी चुनौतियां हैं। विशेष रूप से, अलगाव विधियों की आवश्यकता है जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्केलेबल और विविध ईवी-उत्पादक जीवों के साथ संगत हैं। ईवी अलगाव और अनुसंधान विधियों की योजना और रिपोर्टिंग के लिए सिद्धांतों का एक एकीकृत सेट बनाने के लिए, इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स एमआईएसईवी स्थिति पेपर9 को प्रकाशित और अपडेट करता है। इसके अलावा, ईवी-ट्रैक कंसोर्टियमपारदर्शिता बढ़ाने के लिए प्रकाशित पांडुलिपियों में उपयोग किए जाने वाले ईवी अलगाव के लिए विस्तृत पद्धतियों की रिपोर्टिंग के लिए एक खुला मंच प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल में, स्तनधारी सेल संस्कृति से ईवी के अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली पिछली पद्धतियों कोबैक्टीरियल सेल संस्कृति से ईवी के अलगाव को सक्षम करने के लिए 11,12 अनुकूलित किया गया था। हमने उन तरीकों को नियोजित करने की मांग की जो विभिन्न प्रकार के रोगाणुओं से ईवी अलगाव को सक्षम करते हैं, जो स्केलेबल हो सकते हैं, और ईवी शुद्धता और उपज को संतुलित करते हैं (जैसा कि एमआईएसईवी स्थिति पेपर9 में चर्चा की गई है)। सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन द्वारा जीवाणु कोशिकाओं और मलबे को हटाने के बाद, कल्चर माध्यम या तो केन्द्रापसारक डिवाइस अल्ट्राफिल्ट्रेशन (~ 100 एमएल तक की मात्रा के लिए) या पंप-संचालित टीएफएफ (बड़ी मात्रा के लिए) द्वारा केंद्रित होता है। ईवी को तब एसईसी द्वारा छोटे ईवी के शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित कॉलम का उपयोग करके अलग किया जाता है।
चित्रा 1: बैक्टीरियल ईवी अलगाव वर्कफ़्लो योजनाबद्ध अवलोकन। संक्षेप: ईवी = बाह्य पुटिका; टीएफएफ = स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; MWCO = आणविक भार कट-ऑफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एस्चेरिचिया कोली (यानी, ई कोलाई एमपी1 13) के एक माउस-कॉमेंसल स्ट्रेन का उपयोग एक मॉडल जीव के रूप में किया गया था और साइटोलिसिन ए में संलयन द्वारा ईवी से जुड़े नैनोलुसिफेरस को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया था, जैसा कि पहले बताया गयाथा। यहां उपयोग की जाने वाली विधियां कम से कम कई लीटर बैक्टीरिया संस्कृतियों को संसाधित कर सकती हैं और गैर-ईवी-संबद्ध प्रोटीन से ईवी-संबद्ध को प्रभावी ढंग से अलग कर सकती हैं। अंत में, इस विधि का उपयोग अन्य ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक जीवाणु प्रजातियों के लिए भी किया जा सकता है। रिपोर्ट किए गए प्रयोगों के सभी प्रासंगिक डेटा ईवी-ट्रैक नॉलेजबेस (ईवी-ट्रैक आईडी: ईवी 210211)10 को प्रस्तुत किए गए थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त प्रोटोकॉल में, एक विधि का वर्णन किया गया है जो स्केलेबल है और विश्वसनीय रूप से ईवी को विभिन्न ग्राम-नकारात्मक / सकारात्मक और एरोबिक / एनारोबिक बैक्टीरिया से अलग करता है। इसमें पूरी प्रक्रिया मे?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ऊपर वर्णित शोध एनआईएच टीएल 1 टीआर 002549-03 प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित था। हम कण आकार विश्लेषक उपकरण तक पहुंच की सुविधा के लिए डॉ जॉन सी टिल्टन और ज़चारी ट्रॉयर (केस वेस्टर्न रिजर्व यूनिवर्सिटी) को धन्यवाद देते हैं; कण आकार वितरण डेटा के विश्लेषण के साथ तकनीकी सहायता के लिए ल्यू ब्राउन (स्पेक्ट्राडाइन); कॉर्नेल विश्वविद्यालय में डॉ डेविड पुतनाम पीसीएए-जीएफपी प्लास्मिड14 प्रदान करने के लिए; और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में डॉ मार्क गौलियन हमें ई कोलाई एमपी 113 प्रदान करने के लिए।
Materials
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6×500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
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