Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien
Summary
Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.
Abstract
Verschiedene Bakterienarten sezernieren ~20-300 nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Glykanen und anderen Molekülen bestehen, die von den Elternzellen stammen. EVs fungieren als intra- und interspezielle Kommunikationsvektoren und tragen gleichzeitig zur Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsorganismen im Kontext von Infektion und Besiedlung bei. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die EVs in Gesundheit und Krankheit zugeschrieben werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, EVs für In-vitro- und In-vivo-Studien zu isolieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Trennung von EVs basierend auf physikalischen Eigenschaften, nämlich der Größe, die Isolierung von Vesikeln aus verschiedenen Bakterienkulturen erleichtern würde.
Der Isolationsworkflow besteht aus Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Isolierung von EVs aus Bakterienkulturen. Ein pumpengetriebener Tangential-Flow-Filtrationsschritt (TFF) wurde integriert, um die Skalierbarkeit zu verbessern und die Isolierung von Material aus Litern Ausgangszellkultur zu ermöglichen. Escherichia coli wurde als Modellsystem verwendet, das EV-assoziierte Nanoluciferase und nicht-EV-assoziierte mCherry als Reporterproteine exprimiert. Die Nanoluciferase wurde gezielt auf die EVs gerichtet, indem ihr N-Terminus mit Cytolysin A fusioniert wurde. Frühe Chromatographiefraktionen, die 20-100 nm EVs mit assoziiertem Cytolysin A – nanoLuc enthielten, unterschieden sich von den späteren Fraktionen, die die freien Proteine enthielten. Das Vorhandensein von EV-assoziierter Nanoluciferase wurde durch Immunogold-Markierung und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Dieser EV-Isolations-Workflow ist auf andere gramnegative und grampositive Bakterienarten anwendbar, die mit dem menschlichen Darm assoziiert sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration/TFF und SEC eine skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterienarten ermöglicht. Die Verwendung eines standardisierten Isolationsworkflows wird vergleichende Studien mikrobieller Elektrofahrzeuge über Spezies hinweg erleichtern.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanometergroße, liposomenähnliche Strukturen, die aus Lipiden, Proteinen, Glykanen und Nukleinsäuren bestehen und sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen abgesondert werden1. Seit den frühen Studien, die die Freisetzung von EVs aus gramnegativen Bakterien visualisierten2, hat die Anzahl der biologischen Funktionen, die bakteriellen EVs (20-300 nm Durchmesser) zugeschrieben werden, in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen. Zu ihren Funktionen gehören die Übertragung von Antibiotikaresistenz3, Biofilmbildung4, Quorum Sensing5 und Toxinabgabe6. Es besteht auch ein wachsendes Interesse an der Verwendung bakterieller EVs als Therapeutika, insbesondere in der Vakzinologie7 und Krebstherapie8.
Trotz des wachsenden Interesses an der EV-Forschung gibt es immer noch technische Herausforderungen in Bezug auf Methoden der Isolierung. Insbesondere besteht ein Bedarf an Isolationsmethoden, die reproduzierbar, skalierbar und kompatibel mit verschiedenen EV-produzierenden Organismen sind. Um einen einheitlichen Satz von Prinzipien für die Planung und Berichterstattung von EV-Isolierung und Forschungsmethoden zu schaffen, veröffentlicht und aktualisiert die International Society for Extracellular Vesicles das MISEV-Positionspapier9. Darüber hinaus bietet das EV-TRACK-Konsortium eine offene Plattform für die Berichterstattung über detaillierte Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in veröffentlichten Manuskripten verwendet werden, um die Transparenz zu erhöhen10.
In diesem Protokoll wurden frühere Methoden zur Isolierung von EVs aus Säugetierzellkulturen angepasst11,12, um die Isolierung von EVs aus bakteriellen Zellkulturen zu ermöglichen. Wir haben versucht, Methoden einzusetzen, die eine EV-Isolierung von einer Vielzahl von Mikroben ermöglichen, die skalierbar sein können, und EV-Reinheit und -Ausbeute ausgleichen (wie im MISEV-Positionspapier9 diskutiert). Nach dem Entfernen von Bakterienzellen und Trümmern durch Zentrifugation und Filtration wird das Kulturmedium entweder durch Zentrifugalgeräte-Ultrafiltration (für ein Volumen von bis zu ~100 ml) oder pumpengetriebene TFF (für größere Volumina) konzentriert. Elektrofahrzeuge werden dann durch SEC mit Säulen isoliert, die für die Reinigung kleiner Elektrofahrzeuge optimiert sind.
Abbildung 1: Übersicht über den Workflow für die bakterielle EV-Isolierung. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; TFF = tangentiale Strömungsfiltration; SEC = Größenausschlusschromatographie; MWCO = Molekulargewichtsgrenze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ein Mauskommensalstamm von Escherichia coli (d.h. E. coli MP113) wurde als Modellorganismus verwendet und modifiziert, um EV-assoziierte Nanoluciferase durch Fusion zu Cytolysin A zu exprimieren, wie bereits berichtet14. Die hier verwendeten Methoden können mindestens bis zu mehreren Litern Bakterienkulturen verarbeiten und EV-assoziierte von nicht-EV-assoziierten Proteinen effektiv trennen. Schließlich kann diese Methode auch für andere grampositive und gramnegative Bakterienarten angewendet werden. Alle relevanten Daten der gemeldeten Experimente wurden an die EV-TRACK Knowledgebase (EV-TRACK ID: EV210211)10 übermittelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im obigen Protokoll wird eine Methode beschrieben, die skalierbar ist und EVs zuverlässig von verschiedenen gramnegativen/positiven und aeroben/anaeroben Bakterien isoliert. Es hat mehrere potenzielle Haltepunkte während des gesamten Verfahrens, obwohl es besser ist, nicht länger als 48 Stunden zu benötigen, um EVs aus konditionierten Bakterienkulturmedien zu isolieren.
Erstens besteht es aus der Kultivierung von Bakterien, um ein konditioniertes Bakterienkulturmedium zu erzeugen. Es wurde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die oben beschriebene Forschung wurde durch NIH TL1 TR002549-03 Training Grant unterstützt. Wir danken Dr. John C. Tilton und Dr. Zachary Troyer (Case Western Reserve University) für die Erleichterung des Zugangs zum Partikelgrößenanalysegerät; Lew Brown (Spectradyne) für technische Unterstützung bei der Analyse der Partikelgrößenverteilungsdaten; Dr. David Putnam von der Cornell University für die Bereitstellung von pClyA-GFP-Plasmid14; und Dr. Mark Goulian von der University of Pennsylvania für die Bereitstellung des E. coli MP113.
Materials
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6×500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
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