Måling af cellekantfremspringsdynamik under spredning ved hjælp af levende cellemikroskopi
Summary
Denne protokol har til formål at måle de dynamiske parametre (fremspring, tilbagetrækninger, flæser) af fremspring ved kanten af spredende celler.
Abstract
Udviklingen og homeostasen af flercellede organismer er afhængige af koordineret regulering af cellemigration. Cellemigration er en væsentlig begivenhed i konstruktionen og regenereringen af væv og er kritisk i embryonal udvikling, immunologiske reaktioner og sårheling. Dysregulering af cellemotilitet bidrager til patologiske lidelser, såsom kronisk inflammation og kræftmetastase. Cellemigration, vævsinvasion, axon og dendritudvækst initierer alle med actinpolymerisationsmedierede cellekantfremspring. Her beskriver vi en enkel, effektiv, tidsbesparende metode til billeddannelse og kvantitativ analyse af cellekantfremspringsdynamik under spredning. Denne metode måler diskrete træk ved cellekantmembrandynamik, såsom fremspring, tilbagetrækninger og flæser, og kan bruges til at vurdere, hvordan manipulationer af centrale actinregulatorer påvirker cellekantfremspring i forskellige sammenhænge.
Introduction
Cellemigration er en kritisk proces, der styrer udviklingen og funktionen af alle levende organismer. Cellemigration forekommer under både fysiologiske tilstande, såsom embryogenese, sårheling og immunrespons og under patologiske tilstande, såsom kræftmetastase og autoimmun sygdom. På trods af forskelle i celletyper, der deltager i forskellige migrationshændelser, deler alle cellemotilitetshændelser lignende molekylære mekanismer, som er blevet bevaret i evolutionen fra protozoer til pattedyr og involverer fælles cytoskeletale kontrolmekanismer, der kan fornemme miljøet, reagere på signaler og modulere celleadfærd som reaktion1.
En indledende fase i cellemigration kan være dannelsen af meget dynamiske fremspring i forkanten af cellen. Bag lamellipodiet kan man finde lamellen, som kobler actin til myosin II-medieret kontraktilitet og medierer vedhæftning til det underliggende substrat. Lamellipodi induceres af ekstracellulære stimuli såsom vækstfaktorer, cytokiner og celleadhæsionsreceptorer og drives af actinpolymerisation, som tilvejebringer den fysiske kraft, der skubber plasmamembranen fremad2,3. Mange signal- og strukturelle proteiner har været impliceret i dette; blandt dem er Rho GTPaser, som virker koordineret med andre signaler for at aktivere actinregulerende proteiner såsom Arp 2/3-komplekset, WASP-familieproteiner og medlemmer af Formin- og Spire-familierne i lamellipodia2,4,5.
Ud over actinpolymerisation kræves myosin II-aktivitet til generering af kontraktile kræfter ved lamellipodium og den forreste lamel. Disse sammentrækninger, også defineret som cellekant retractioner, kan også skyldes depolymerisering af dendritisk actin i celle periferien og er afgørende for at udvikle den lamellipodiale forkant og tillade fremspringet at fornemme fleksibiliteten i den ekstracellulære matrix og andre celler og bestemme migrationsretningen6,7,8 . Cellekantfremspring, der ikke kan fastgøres til substratet, vil danne perifere membranflæser, arklignende strukturer, der vises på den ventrale overflade af lamellipodia og lameller og bevæger sig baglæns i forhold til migrationsretningen. Da lamellipodium ikke fastgøres til substratet, dannes et bageste lamellipodium under det og skubber mekanisk det første lamellipodium mod den øvre ventrale overflade. Actinfilamenterne i flæsen, der tidligere var parallelle med substratet, bliver nu vinkelret på det, og flæsen er nu placeret over det fremrykkende lamellipodium. Flæsen, der bevæger sig baglæns, falder tilbage i cytosolen og repræsenterer en cellulær mekanisme til genanvendelse af lamellipodial actin9,10.
Her beskriver vi et assay til måling af cellekantfremspringsdynamik. Fremspringsassayet bruger time-lapse-videomikroskopi til at måle fremspringsdynamikken på en enkelt cellekant i 10 minutter under cellens spredningsfase. Fremspringsdynamik analyseres ved at generere kymografer fra disse film. I princippet giver en kymograf detaljerede kvantitative data om bevægelige partikler i et spatiotemporalt plot for at give en kvalitativ forståelse af cellekantdynamikken. Intensiteten af den bevægelige partikel afbildes for alle billedstakke i et tids- versus rumplot, hvor X-aksen og Y-aksen repræsenterer henholdsvis tid og afstand11. Denne metode bruger en manuel kymografanalyse med ImageJ til at få detaljerede kvantitative data, der gør det muligt at hente information fra film og billeder i tilfælde af lavt signal-støj-forhold og / eller høj funktionstæthed og analyse af billeder erhvervet i fasekontrastlysmikroskopi eller dårlig billedkvalitet.
Cellekantens fremspringsdynamikassay beskrevet heri er en hurtig, enkel og omkostningseffektiv metode. Som sådan, og fordi det har vist sig at korrelere direkte med cellemigration11,12, kan det bruges som en foreløbig metode til test af cytoskeletal dynamik involveret i cellemotilitet, før det besluttes at udføre mere ressourcekrævende metoder. Desuden muliggør det også kvantitativ måling af, hvordan genetiske manipulationer (knockout, knockdown eller redningskonstruktioner) af cytoskeletale proteiner påvirker cytoskeletal dynamik ved hjælp af en ligetil platform. Assayet er en lærerig model til at udforske cytoskeletal dynamik i forbindelse med cellemigration og kan bruges til belysning af de mekanismer og molekyler, der ligger til grund for cellemotilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellekant fremspringsdynamik, der består af fremspring, tilbagetrækninger og flæser, er både en forudsætning og en potentiel hastighedsbegrænsende begivenhed i cellemotilitet. Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til måling af dynamikken i cellekantfremspring under spredning. Denne metode muliggør korttidsbilleddannelse, genererer en betydelig mængde data, kræver ikke fluorescerende mærkning af celler eller dyrt fluorescerende mikroskopiudstyr og kan bruges som en foreløbig metode til test af cytoskelet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH MH115939, NS112121, NS105640 og R56MH122449-01A1 (til Anthony J. Koleske) og fra Israel Science Foundation (tilskud nummer 1462/17 og 2142/21) (til Hava Gil-Henn).
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. . The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers–assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochimie. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
