生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定
Summary
このプロトコルは、広がる細胞の端にある突起の動的パラメータ(突起、収縮、フリル)を測定することを目的としています。
Abstract
多細胞生物の発生と恒常性は、細胞移動の協調的な調節に依存している。細胞遊走は、組織の構築および再生において不可欠な事象であり、胚発生、免疫学的応答、および創傷治癒において重要である。細胞運動性の調節不全は、慢性炎症および癌転移などの病理学的障害に寄与する。細胞遊走、組織浸潤、軸索、および樹状突起伸長はすべて、アクチン重合媒介性細胞縁突起で開始される。ここでは、拡散中の細胞端突起ダイナミクスのイメージングおよび定量分析のための、シンプルで効率的で時間を節約する方法について説明する。この方法は、突起、収縮、フリルなどの細胞端膜ダイナミクスの離散的な特徴を測定し、主要なアクチン調節因子の操作が多様な文脈で細胞縁突起にどのように影響するかを評価するために使用することができる。
Introduction
細胞移動は、すべての生物の発達と機能を制御する重要なプロセスです。細胞遊走は、胚発生、創傷治癒、免疫応答などの生理学的状態と、癌転移および自己免疫疾患などの病理学的状態の両方で起こる。異なる遊走事象に関与する細胞型の違いにもかかわらず、すべての細胞運動性事象は、原生動物から哺乳動物への進化において保存されてきた類似の分子機構を共有し、環境を感知し、シグナルに応答し、応答における細胞挙動を調節することができる共通の細胞骨格制御機構を含む1。
細胞遊走の初期段階は、細胞の前縁における非常に動的な突起の形成であり得る。ラメリポジウムの背後には、アクチンをミオシンII媒介性収縮性に結合し、下層の基質への接着を媒介するラメラがある。ラメリポジアは、成長因子、サイトカイン、細胞接着受容体などの細胞外刺激によって誘導され、原形質膜を前方に押し出す物理的な力を提供するアクチン重合によって駆動されます2,3。多くのシグナル伝達および構造タンパク質がこれに関与している。その中にはRho GTPaseがあり、これは他のシグナルと協調して作用し、Arp 2/3複合体、WASPファミリータンパク質、およびラメリポディアのホルミンファミリーおよびスパイアファミリーのメンバーなどのアクチン調節タンパク質を活性化する2,4,5。
アクチン重合に加えて、ミオシンII活性は、ラメリポジウムおよび前層に収縮力を発生させるために必要とされる。細胞縁収縮としても定義されるこれらの収縮は、細胞末梢における樹状アクチンの解重合からも生じ得、層状前縁を発達させ、突起が細胞外マトリックスおよび他の細胞の柔軟性を感知し、遊走の方向を決定することを可能にするために重要である6,7,8.基材に付着できない細胞縁突起は、末梢膜フリル、層状および層状突起の腹面に現れ、遊走方向に対して後方に移動するシート状構造を形成する。ラメリポジウムが基板に付着しないと、後部ラメリポジウムがその下に形成され、機械的に第1のラメリポジウムを上腹面に向かって押し出す。以前は基質に平行であったフリルのアクチンフィラメントは、現在、基質に対して垂直になり、フリルは前進するラメリポジウムの上に配置されるようになった。後方に移動するフリルは細胞質ゾルに逆戻りし、層状体アクチンをリサイクルするための細胞機構を表しています9,10。
ここで、細胞縁突起ダイナミクスの測定のためのアッセイについて説明する。突出アッセイは、タイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、細胞の拡散期中に単一細胞エッジ突起ダイナミクスを10分間測定します。突起ダイナミクスは、これらの映画からキモグラフを生成することによって解析される。原理的には、キモグラフは、移動粒子の詳細な定量データを時空間プロットで付与し、細胞エッジダイナミクスの定性的理解をもたらす。移動する粒子の強度は、時間対空間プロットのすべての画像スタックに対してプロットされ、X軸とY軸はそれぞれ時間と距離を表します11。ImageJによる手動キモグラフ解析により詳細な定量データを取得し、低信号対雑音比や高特徴密度の場合に動画や画像から情報を取得したり、位相コントラスト光顕微鏡で取得した画像や画質の悪さを解析したりすることができます。
本明細書に記載される細胞縁突起ダイナミクスアッセイは、迅速、単純、かつ費用対効果の高い方法である。このように、そして細胞遊走と直接相関することが示されているので11、12、より資源の要求の厳しい方法を実行することを決定する前に、細胞運動性に関与する細胞骨格ダイナミクスを試験するための予備的方法として使用することができる。さらに、細胞骨格タンパク質の遺伝子操作(ノックアウト、ノックダウン、またはレスキューコンストラクト)が細胞骨格ダイナミクスにどのように影響するかを、簡単なプラットフォームを使用して定量的に測定することもできます。このアッセイは、細胞遊走の文脈における細胞骨格ダイナミクスを探索するための有益なモデルであり、細胞運動性の根底にあるメカニズムおよび分子の解明に使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
突起、収縮、およびフリルからなる細胞端突起ダイナミクスは、細胞運動性の前提条件であり、潜在的な律速事象でもある。ここでは、拡散中の細胞エッジ突起のダイナミクスを測定するための迅速かつ簡単な方法について説明します。この方法は、短時間のイメージングを可能にし、大量のデータを生成し、細胞の蛍光標識や高価な蛍光顕微鏡装置を必要とせず、よりリソースのかかる方?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH MH115939、NS112121、NS105640、R56MH122449-01A1(アンソニー・J・コレスケ宛)およびイスラエル科学財団(助成金番号1462/17および2142/21)(ハバ・ギル・ヘン宛)の助成金によって支援された。
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. . The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers–assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochimie. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
