Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi
Summary
Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Çok hücreli organizmaların gelişimi ve homeostazı, hücre göçünün koordineli bir şekilde düzenlenmesine dayanır. Hücre göçü, dokuların yapımında ve yenilenmesinde önemli bir olaydır ve embriyonik gelişimde, immünolojik yanıtlarda ve yara iyileşmesinde kritik öneme sahiptir. Hücre hareketliliğinin düzensizliği, kronik inflamasyon ve kanser metastazı gibi patolojik bozukluklara katkıda bulunur. Hücre göçü, doku invazyonu, akson ve dendrit büyümesi, aktin polimerizasyonu aracılı hücre kenarı çıkıntıları ile başlar. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin görüntülenmesi ve kantitatif analizi için basit, verimli, zaman kazandıran bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar gibi hücre kenarı membran dinamiklerinin ayrık özelliklerini ölçer ve anahtar aktin düzenleyicilerinin manipülasyonlarının çeşitli bağlamlarda hücre kenarı çıkıntılarını nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Hücre göçü, tüm canlı organizmaların gelişimini ve işlevini kontrol eden kritik bir süreçtir. Hücre göçü hem embriyogenez, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi gibi fizyolojik durumlarda hem de kanser metastazı ve otoimmün hastalık gibi patolojik durumlarda ortaya çıkar. Farklı göç olaylarında yer alan hücre tiplerindeki farklılıklara rağmen, tüm hücre hareketlilik olayları, protozoalardan memelilere evrimde korunmuş olan benzer moleküler mekanizmaları paylaşır ve çevreyi algılayabilen, sinyallere yanıt verebilen ve yanıt olarak hücre davranışını modüle edebilen ortak hücre iskeleti kontrol mekanizmalarını içerir1.
Hücre göçünde ilk aşama, hücrenin ön kenarında oldukça dinamik çıkıntıların oluşumu olabilir. Lamellipodyumun arkasında, aktin’i miyozin II aracılı kontraktiliteye bağlayan ve altta yatan substrata yapışmaya aracılık eden lamel bulunabilir. Lamellipodia, büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre adezyon reseptörleri gibi hücre dışı uyaranlar tarafından indüklenir ve plazma zarını ileriye doğru iten fiziksel kuvveti sağlayan aktin polimerizasyonu tarafından tahrik edilir2,3. Birçok sinyal ve yapısal protein buna dahil edilmiştir; Bunlar arasında, Arp 2/3 kompleksi, WASP ailesi proteinleri ve lamellipodia2,4,5’teki Formin ve Spire ailelerinin üyeleri gibi aktin düzenleyici proteinleri aktive etmek için diğer sinyallerle koordineli olarak hareket eden Rho GTPazlar bulunmaktadır.
Aktin polimerizasyonuna ek olarak, lamellipodyum ve anterior lamelde kontraktil kuvvetler üretmek için miyozin II aktivitesi gereklidir. Hücre kenarı retraksiyonları olarak da tanımlanan bu kasılmalar, hücre periferinde dendritik aktinin depolimerizasyonundan da kaynaklanabilir ve lamellipodial ön kenarı geliştirmek ve çıkıntının hücre dışı matrisin ve diğer hücrelerin esnekliğini algılamasına ve göç yönünü belirlemesine izin vermek için kritik öneme sahiptir6,7,8 . Substrata yapışamayan hücre kenarı çıkıntıları, periferik membran fırfırları, lamellipodia ve lamelin ventral yüzeyinde görünen tabaka benzeri yapılar oluşturacak ve göç yönüne göre geriye doğru hareket edecektir. Lamellipodyum substrata yapışamadığından, altında bir posterior lamellipodyum oluşur ve ilk lamellipodyumu mekanik olarak üst ventral yüzeye doğru iter. Daha önce substrata paralel olan fırfırdaki aktin filamentleri şimdi ona dik hale gelir ve fırfır şimdi ilerleyen lamellipodyumun üzerine yerleştirilir. Geriye doğru hareket eden fırfır, sitosol içine geri düşer ve lamellipodial aktinin geri dönüşümü için hücresel bir mekanizmayı temsil eder9,10.
Burada, hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ölçümü için bir tahlil açıklıyoruz. Çıkıntı testi, hücrenin yayılma aşamasında 10 dakika boyunca tek hücre kenarı çıkıntı dinamiklerini ölçmek için hızlandırılmış video mikroskopisi kullanır. Çıkıntı dinamikleri, bu filmlerden kimografiler üretilerek analiz edilir. Prensip olarak, bir kimograf, hücre kenarı dinamiklerinin nitel bir anlayışını sağlamak için uzaysal zamansal bir grafikte hareketli parçacıkların ayrıntılı nicel verilerini verir. Hareketli parçacığın yoğunluğu, X ekseni ve Y ekseninin sırasıyla zaman ve mesafeyi temsil ettiği bir zamana karşı uzay grafiğindeki tüm görüntü yığınları için çizilir11. Bu yöntem, ayrıntılı nicel veriler elde etmek için ImageJ ile manuel bir kimograf analizi kullanır, düşük sinyal-gürültü oranı ve / veya yüksek özellik yoğunluğu durumunda filmlerden ve görüntülerden bilgi alınmasını ve faz kontrastlı ışık mikroskobu veya düşük görüntü kalitesinde elde edilen görüntülerin analizini sağlar.
Burada açıklanan hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi hızlı, basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu nedenle ve hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterildiğinden11,12, daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar vermeden önce hücre hareketliliğinde yer alan sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Ayrıca, sitoiskelet proteinlerinin genetik manipülasyonlarının (nakavt, nakavt veya kurtarma yapıları) basit bir platform kullanarak sitoiskelet dinamiklerini nasıl etkilediğinin nicel ölçümünü de sağlar. Tahlil, hücre göçü bağlamında sitoiskelet dinamiklerini araştırmak için öğretici bir modeldir ve hücre hareketliliğinin altında yatan mekanizmaların ve moleküllerin aydınlatılması için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çıkıntılar, retraksiyonlar ve fırfırlardan oluşan hücre kenarı çıkıntı dinamikleri, hücre hareketliliğinde hem bir ön koşul hem de potansiyel bir hız sınırlayıcı olaydır. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntılarının dinamiklerini ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem kısa süreli görüntülemeyi mümkün kılar, önemli miktarda veri üretir, hücrelerin floresan etiketlemesini veya pahalı floresan mikroskopi ekipmanı gerektirmez ve daha fazl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH MH115939, NS112121, NS105640 ve R56MH122449-01A1 (Anthony J. Koleske’ye) ve İsrail Bilim Vakfı’ndan (1462/17 ve 2142/21 numaralı hibeler) (Hava Gil-Henn’e) hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C – Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. . The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers–assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochimie. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
