엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양
Summary
전체 배아 배양을 위한 향상된 플랫폼은 사전 배기 단계부터 고급 유기발생까지 최대 6일 동안 이식 후 마우스 배아의 연속적이고 강력한 전자궁 개발을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 정적 플레이트와 회전 병 시스템을 사용하여 성공적인 배아 배양을 위한 표준 절차를 자세히 설명합니다.
Abstract
이식 후 포유류 배아 배양 방법은 일반적으로 비효율적이고 자궁에서 해부 후 짧은 기간으로 제한되었습니다. 플랫폼은 최근에 향상된 유기발생까지 계란 실린더 단계에서 마우스 배아의 매우 강력하고 장기간 전 자궁 배양을 위해 개발되었습니다. 이러한 플랫폼은 뒷두개 형성 단계(E11)까지 배아(E5.5)를 예식하는 적절하고 충실한 개발을 가능하게 한다. 늦은 가스루 배아(E7.5)는 이러한 설정에서 회전병에서 재배되는 반면, 예기 단계(E5.5 또는 E6.5)에서 확장된 배양은 정적 및 회전 병 배양의 조합을 필요로 한다. 또한, O2 및 CO2 농도, 가스 압력, 포도당 수준 및 특정 전 자궁 배양 배지의 사용에 대한 민감한 조절은 적절한 배아 발달에 매우 중요하다. 여기서, 확장된 전자궁 마우스 배아 배양을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공된다. 기체에서 유기발생에 이르는 정상 마우스 배아 전 자궁 을 성장시키는 능력은 배아 발달 중 다른 실험적 동요의 효과를 특성화하기 위한 귀중한 도구를 나타낸다.
Introduction
포유류 배아의 자궁 내 발달은 이식 후 발달의 초기 단계의 연구를 제한했다1,2. 개발 배아의 접근성은 동물 체형 계획의 수립, 세균 층의 사양 또는 조직 및 장기의 형성과 같은 자궁으로 배아 임플란트 후 발생하는 주요 발달 과정의 이해를 방해합니다. 더욱이, 초기 이식 후 배아의 아주 작은 크기는 E103 의 앞에 자궁에 있는 본질적인 화상 진찰에 의해 관찰하기 어렵게 만듭니다. 이 단계에서 살아있는 태아를 관찰하고 조작하는 무능력은 발달 도중 스냅샷에 초기 이식 후 배아 발생의 연구 연구를 제한했습니다.
전 이식 포유류 배아의 체외 배양을 위한 프로토콜은 잘 확립되고, 믿을 수 있고, 정기적으로 이용됩니다4. 그럼에도 불구하고, 적절한 포유류 이식 후 배아 성장을 지원할 수 있는 자궁 배양 시스템을 확립하려는 시도는 성공을 제한했다5. 종래의 정적 판에서 배아를 배양함으로써 100년 이상 다양한 배양 기술이 제안되어 왔으며, 주로 종래의 정적 플레이트6,7,8 또는 회전병(롤러 배양)5,9,10에서 배아를 배양함으로써 제안되었다. 이 플랫폼은 이식 후 포유류 개발에 대한 지식을 확장하는 데 도움이 입증11,12, 정상적인 배아 생존을 위해 매우 비효율적이고 짧은 기간에 제한에도 불구하고. 배아는 문화 개시 후 24-48 h로 발달 지체 및 형태 학적 이상을 표시하기 시작했다.
본 연구는 사전 접종에서 최대 6일간의 고급 유기발생 단계로의 지속적인 발달을 허용하는 전 자궁 배아 배양 시스템을 설정하기 위한 상세한 설명을 제공한다13. 이 논문은 정전기 판및 롤러 배양 플랫폼에 문화를 결합하여 뒷다리 형성 단계(~E11)와 E5.5/E6.5로부터의 확장배양까지 E7.5 배아(신경판 및 헤드폴드 스테이지)의 성장을 지원하는 개선된 롤러 배양 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에 제시된 배양 프로토콜은 E5.5에서 E11까지 최대 6일 동안 적절하고 지속적인 마우스 배아 발달 ex utero를 유지할 수 있다. 이전에는 이러한 발달 단계에 있는 배아가 짧은 기간 동안만 배양에서 정상적으로 개발할 수 있었습니다(최대 48h)15. 산소 농도 및 고압 가스 압력의 정밀한 제어를 위한 롤러 배양 인큐베이터에 가스 조절 모듈을 결합하는 것은 본 원에 기재?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 파스칼과 일라나 만투에 의해 지원되었다; 유럽 연구 위원회 (ERC-CoG-2016 726497-셀나디티); 승무원 의학 연구 위원회 (FAMRI); 이스라엘 암 연구 기금 (ICRF) 교수, BSF, 헬렌과 마틴 킴멜 줄기 세포 연구를위한 연구소, 헬렌과 혁신적인 조사에 대한 마틴 킴멜 상; 이스라엘 과학 재단 (ISF), 미네르바, 약용 화학에 대한 셔먼 연구소, 넬라와 레온 베노지요 신경 질환에 대한 센터, 유전 질환 연구를위한 데이비드와 펠라 셰이벨 가족 센터, 의학 유전학에 대한 케이스트 가족 연구소, 박사 베스 롬 – 라이머 줄기 세포 연구 기금, 에드먼드 드 로스 차일드 재단, 잔트 커 자선 재단, Zvia 제로니의 부동산.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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