Mikrokirurgiska färdigheter för att etablera permanent jugulär venkanylering hos råttor för seriell blodprovtagning av oralt administrerat läkemedel

Summary

Detaljerade mikrokirurgiska tekniker demonstreras för att etablera en långsiktig jugular venkanyleringsråttmodell för sekventiell bloduppsamling i samma djur. Fysiologiska och hematologiska parametrar har övervakats under råttans återhämtningsfas. Denna modell har tillämpats för att studera farmakokinetiken för oralt administrerad polyfenol utan att inducera djurstress.

Abstract

Blodprovtagning hos små försöksdjur är nödvändig för farmaceutisk blyoptimering men kan orsaka stor skada och stress för försöksdjur, vilket potentiellt kan påverka resultaten. Halsvenkanyreringen (JVC) hos råttor är en allmänt använd modell för upprepad blodinsamling men kräver adekvat utbildning av kirurgiska färdigheter och djurvård. Denna artikel beskriver de mikrokirurgiska förfarandena för att upprätta och upprätthålla en permanent JVC-råttmodell med särskilt fokus på placering och tätning av halskanylen. Vikten av att övervaka fysiologiska (t.ex. kroppsvikt, mat och vattenintag) och hematologiska parametrar, belystes med resultat som presenterades i 6 dagar efter operationen under råttans återhämtning. Läkemedels-plasmakoncentration-tidsprofilen för oralt administrerad naturlig fenolelaginsyra bestämdes i JVC-råttmodellen.

Introduction

Upprepad insamling av blodprover från små försöksdjur, såsom gnagare, marsvin och kaniner, är en viktig aspekt för farmaceutisk blyoptimering och även för att minska antalet djur som används i forskning ^1,2. Pipelinen för att utveckla nya diagnostiska verktyg och läkemedelsformulering (t.ex. vaccin) kräver tillgång till olika volymer blod för att utvärdera deras robusthet och prestanda in vivo, såsom farmakokinetik (PK), toxicitet och känslighet ^3,4,5.

Laboratoriemetoden för blodprovsinsamling klassificeras i stort sett i två typer, kirurgisk och icke-kirurgisk⁶. Det icke-kirurgiska tillvägagångssättet är relativt lätt att förstå för forskaren, vilket inkluderar vanliga tekniker, såsom hjärtpunktering, orbital sinuspunktur och blödning av saphenös och svansven. Flera blodprovtagningar är möjliga med vissa icke-kirurgiska metoder, men provvolymen är liten och kan orsaka fysisk sår och psykisk stress hos djuren¹. Å andra sidan är det kirurgiska tillvägagångssättet ett favoritalternativ till upprepad venipunktur, och det innebär placering av en tillfällig eller permanent kanyl i blodkärlen hos djur ^7,8,9. Den stora blodvolymen kan upprepade gånger dras tillbaka genom kanylen hos medvetna råttor samtidigt som man undviker stress och smärta på grund av hanteringstekniken, återhållsamhet och anestesi 7,8,10,11. Kanylimplantationen kräver emellertid en erfaren forskare med adekvat utbildning för att framgångsrikt samla blodet.

Bloduppsamling genom halsvenkanylering (JVC) hos råttor är den mest använda metoden för att studera läkemedlet PK 6,10,12,13. Ändå kräver etablering av JVC-råttmodellen noggrann övning av mikrokirurgiska färdigheter och kunskap om postkirurgisk vård och underhåll. Speciellt efter operationen kräver råttan administrering av smärtstillande medel och tillräcklig återhämtningstid för att nå stabilt fysiologiskt tillstånd för ytterligare experiment 13,14,15. Även om kroppsviktökningen (dvs. >10 g) är en giltig och vanligt tillämpad indikator för råttans återhämtning, är det inte ovanligt att råttorna har oväntad död postoperativt på grund av uttorkning, infektion och inflammation, vilket kan vara subtilt att märka vid tidig debut^14,15. Dessutom är kateterobstruktion i JVC-modellen fortfarande ett problem under blodinsamlingen.

Det nuvarande protokollet har i detalj visat de mikrokirurgiska förfarandena för JVC hos en sövd råtta med specifikt fokus på identifiering, isolering och kanylering av halsvenen. Vikten av fysiologisk och hematologisk övervakning av råttorna under återhämtningsfasen betonas. Slutligen samlades seriella blodprover in genom venkatetern för att studera PK för den oralt administrerade naturliga fenolelsyran med dålig biotillgänglighet (dvs. låg systemisk koncentration) för att verifiera JVC-råttmodellen.

Protocol

De förfaranden som beskrivs nedan utfördes som en del av ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Northwestern Polytechnical University (nr 202101117). 1. Preoperativ beredning (dagen före operationen) OBS: Erforderliga lösningar: normal saltlösning (0,9% w / v natriumklorid), hepariniserad saltlösning (1% w / v heparinnatrium), kateterlåslösning, icke-steroid antiinflammatoriskt läkemedel (NSAID), såsom …

Representative Results

Detta protokoll har grundligt visat hur man etablerar en långsiktig JVC-modell med hjälp av mikrokirurgiska färdigheter för seriell blodinsamling. Figur 1A visar de väsentliga kirurgiska instrument och material som används för att genomföra operationen. Specifikationen av PU-kateter med tre blå märken illustreras också, vilket är till hjälp för att vägleda forskaren att placera venkanyeln i steg 3.3., hur man använder märkena på PU-katetern för att styra kanylen (…

Discussion

Mastering av tekniken för fartygsburkulering kräver betydande övning och lärdom av varje operation. Christakis et al. med hjälp av kumulativ summa (CUSUM) analys, fann att en forskare behöver öva 200 råttor under en period av ett år innan han är redo för PK-utvärdering av läkemedelskandidater²⁰. Ändå kan den driftstid som krävs för venens kanylering minskas avsevärt med antalet råttor som utförs ^13,20. Med hjälp av vå…

Materials

0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant	Xinkang	N/A	collecting blood samples for hematology test
0.5*20 mm 1.0-mL syringe	KLMEDICAL	N/A	washing or replacing the fluid with saline
0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe	HD	N/A	Subcutaneous injection
1.0-mL Blunt tipped syringe (22G)	skillsmodel	S4-PKT22G	Inject the saline and collect blood samples through catheter
1.5 mL sterile microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S	Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution
1.5 mL microcentrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M	blood collection
1/2  circle cutting 5*12 mm suture needle	skillsmodel	S4-FHZ	Thread the muscle layer to fix the catheter
3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle	skillsmodel	S5-FHZ	Suture the incision of rat cortex
6-0 sterile non-absorbable silk suture thread	JUNSHENG	N/A	ligature
75% medical alcohol	HONGSONG	N/A	Disinfection
Adhensive tape	LIUTAI	N/A	positioning the rat
Autoclave sterilization tape	Biosharp	BS-QT-028	Mark sterilized items
Automated blood cell counter	Sysmex	XN-550	Hematology test
Castroviejo micro scissors	skillsmodel	WA1010	Cut the opening in the blood vessel
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Plasma preparation
Clean cushion	Qingjie	N/A	Prepare the operation area
Cotton balls	HC	N/A	Wound disinfection and sterilization
Cotton swabs	BEITAGOGO	N/A	Disinfection
Curved hemostat	skillsmodel	N/A	ligature
DN50 Stainless-steel rat restrainer	skillsmodel	S4-RGDQ1	Restrict the movement of rats for easy operation
Ellagic acid	Aladdin	E102710-25g	natural phenol for oral administration
Half-curved forceps	skillsmodel	53072	Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture
Heating pad	Warm mate	N/A	preventing heat loss of animal
Heparin sodium	Solarbio	H8060	anticoagulant
Iodophor	Xidebao	N/A	Clean the wound
Iris scissors	skillsmodel	54002	Bluent separation the muscle layer
Isoflurane	RWD	R510-22-16	anaesthesia
LED lamp	EMPERORFEEL	N/A	sugery
Liquid chromatography-mass spectroscopy	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	detection of drug concentration in plasma
Meloxicam	Hongqiang	N/A	Analgesic
Normal saline	KL	N/A	Prepara the solution and protect blood vessels from drying out
Pet razor	Codos	3180	Shaving the fur
Phosphate-buffered saline	ZHHC	PW012	Preparation of Ellagic acid solution
PU catheter	skillsmodel	RJVC-PU	Jugular vein cannulation
Small animal operation anesthesia console	RWD	68620	Operation workstation
Spray bottle	Other	N/A	aseptic workstation
Stainless steel plug (22G)	skillsmodel	S4-PKD22G	Plug the catheter to ensure its sealing
Stainless steel trochar	skillsmodel	S$-PKDGZ	Guide the catheter exteriorization
Sterile lock solution	skillsmodel	SK-FB	lock the catheter to ensure its sterility
Straight feeding needle	skillsmodel	N/A	Oral gavage
Surgical pouch	BKMAM	N/A	container for sterilization of surgical instruments
Surgical scissors	skillsmodel	J21070	Cut incision on rat skin
Vessel dilator balanced forceps	skillsmodel	WA3020	Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in
ZS-MV Small animal anesthesia machine	ZSLab	1057003	inducing and maintaining anaesthesia