التشريح المجهري وتفكك قناة المبيض المورينية: تحديد الجزء الفردي وعزل الخلية الواحدة

Summary

يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.

Abstract

أنظمة نماذج الفئران لا مثيل لها لتحليل عمليات المرض بسبب قابليتها للتلاعب الجيني وانخفاض تكلفة العلاجات التجريبية. ومع ذلك ، بسبب صغر حجم الجسم ، أثبتت بعض الهياكل ، مثل قناة البيض التي يبلغ قطرها 200-400 ميكرومتر ، أنه من الصعب نسبيا دراستها إلا عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات الكيميائية النسيجية المناعية عن اختلافات أكثر تعقيدا في قطاعات قناة البيض مما كان معترفا به سابقا. وبالتالي ، تنقسم قناة البيض إلى أربعة أجزاء وظيفية بنسب مختلفة من سبعة أنواع متميزة من الخلايا الظهارية. من المحتمل أن تجعل الأصول والنسب الجنينية المختلفة لأنواع الخلايا الظهارية المناطق الوظيفية الأربع عرضة للأمراض بشكل مختلف. فعلى سبيل المثال، تنشأ آفات السلائف للسرطان المصلي داخل الظهارة من الإنفونديبولوم في نماذج الفئران ومن المنطقة الفيمبرية المقابلة في قناة فالوب البشرية. يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة للتشريح المجهري لتقسيم قناة البيض بطريقة تنتج كمية كافية ونقاء من الحمض النووي الريبي الضروري للتحليل النهائي مثل النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq). كما وصفت طريقة تفكك الأنسجة غير الأنزيمية في الغالب المناسبة لقياس التدفق الخلوي أو تحليل RNAseq أحادي الخلية للخلايا البيضية المتمايزة تماما. ستسهل الطرق الموصوفة إجراء مزيد من الأبحاث باستخدام قناة البيض الفئرانية في مجال التكاثر والخصوبة والسرطان والمناعة.

Introduction

تتشابه قناة البيض الفئرانية في وظيفتها ومورفولوجيتها مع قناة فالوب ^{البشرية1}. يتكون كلاهما من ظهارة هدبية زائفة ، تتكون من خليتين مقيمتين ظهاريتين موصوفتين تاريخيا: الخلايا الهدبية والخلايا الإفرازية1,2. تحتوي قناة البيض على ثلاثة أجزاء معترف بها كلاسيكيا: infundibulum و ampulla و isthmus. في دراسة حديثة ، Harwalkar et al. ³ بحث في مورفولوجيا قناة البيض والتعبير الجيني مما أدى إلى توسيع تصنيف الخلايا الظهارية المقيمة إلى سبع مجموعات سكانية متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأوا تقاطع البرزخ الأمبولاري كجزء متميز من قناة ^البيض3. يمكن بسهولة توسيع الطريقة الموصوفة هنا ، والتي تركز على infundibulum و ampulla و برزخ ، لتشمل التقاطع الأمبولاري البرزخي ^أيضا2,3. تحتوي المنطقة القاعية على ostium ، أو فتحة قناة البيض ، وتشمل المنطقة fimbrial وكذلك الساق القريبة. بالانتقال نحو الرحم ، التالي هو الأمبولا ، ثم البرزخ. الخلايا الهدهدية هي الأكثر بروزا في الطرف البعيد من المنطقة ، بالقرب من المبيض ، أو infundibulum ، في حين أن الخلايا الإفرازية هي الأكثر بروزا في الطرف القريب أو جزء البرزخ ¹. على عكس قناة فالوب البشرية ، فإن قناة البيض الفئران هي بنية ملفوفة مدعومة من الميزوسالبينكس ، وهو امتداد للرباط العريض الصفاق ^1,4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغليف قناة بيض الفأر في كيس جرابي يزيد من احتمال نقل البويضات إلى قناة ^البيض4. يتم تحديد الأمبولا على أنها موقع الإخصاب ، الذي تمر منه الأجنة النامية إلى البرزخ قبل دخول ^الرحم5. يبلغ قطر الأجزاء البوقية 200-400 ميكرومتر ويبلغ طول المناطق الأطول من الأمبولاري والبرزخ حوالي 0.5-1.0 ^سم4. تتوزع قناة البيض خلال دورة الاستروس والأمبولا و infundibulum أكثر قابلية للتمدد من ^{البرزخ1}.

إن الإفراط في انتشار الخلايا، وخاصة الخلايا الإفرازية، يميز آفات السلائف إلى الأورام المصلية الموجودة في تجويف ^الحوض6. تنشأ هذه الآفات المصلية داخل الظهارة السلائف في ظهارة قناة البيض فقط في المنطقة الفيمبرية. من غير المعروف لماذا يقتصر تكوين الآفة على هذه المنطقة حيث عادة ما يكون نوع الخلايا السائد مهدبا ، وليس إفرازيا2،^7،8. تؤكد الإقليمية من حيث الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية ، وكذلك الاهتمام المتزايد بالأصل القضوي لسرطان المبيض ⁹،10،^11،12،^{13 ،} على أهمية التقييم المنفصل لقطاعات قناة البيض.

تفصل الطريقة الموصوفة هنا جمع شرائح قنوات البيض المنفصلة للتحليلات اللاحقة في المصب للتعبير الجيني الخاص بالشرائح ووظيفة الخلايا المنفصلة. تقليديا ، تتم معالجة العديد من الأنسجة لاستخراج الحمض النووي الريبي بالكامل باتباع إما الفينول: طريقة الكلوروفورم أو طريقة الاستخراج الكامل على العمود. ومع ذلك ، وجدنا أنه تم الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي مع إنتاج عائد كاف باستخدام طريقة الجمع الموصوفة. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة أجزاء وظيفية صغيرة جدا من قناة البيض للتحليلات النهائية بدلا من التحقيق في قناة البيض ككل، والتي يمكن أن تخفي النتائج التي تمثل القطاعات ^{المختلفة14}.

نادرا ما تم التحقيق في الخلايا المبيضية الفئرانية المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، على الأرجح بسبب الحد من إنتاجية الخلايا من هذا الأنسجة. كان أحد الأساليب للتغلب على هذه المشكلة هو فصل الخلايا ، وتنميتها في الثقافة ، ثم تحفيز إعادة التمايز في المختبر للحصول على أرقام الخلايا المناسبة لتحليل الخلايا في المراحل ^{النهائية15}،^16،17،18. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو الوقت خارج الجسم الحي والبيئة الدقيقة المتغيرة في الثقافة ، وكلاهما من المحتمل أن يغير التعبير الجيني. هناك أيضا افتراض بأن إعادة التمايز المورفولوجي لها نفس التوقيع النسخي والبروتيني كما كان موجودا في الحيوان السليم. تم تصميم طريقة التفكك الحالية لتحقيق أكبر عدد من الخلايا الظهارية في مجموعة خلايا القنوات البيضاوية غير المتجانسة مع الحفاظ على تمايز الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يحد النهج غير الأنزيمي في الغالب من فقدان بروتينات سطح الخلية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع إجراءات ومناولة الحيوانات من قبل جامعة كاليفورنيا ، لجنة ريفرسايد المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن الجمعية الأمريكية لرعاية المختبر ، ووزارة الزراعة الأمريكية ، والمعاهد الوطنية للصحة. استخدمت الطريقة الموصوفة C57BL/6 م?…

Representative Results

ينتج بروتوكول التفكك الموصوف 100،000-120،000 خلية لكل فأر مع تجميع كل من قنوات البيض. هذه الطريقة لطيفة بما يكفي لترك حدود الخلايا متعددة الأهداب سليمة ، مما يسمح بالتمييز بين الخلايا متعددة الأهداب والخلايا الإفرازية ، والتحقق من أن طريقة الهضم لطيفة بما يكفي لمنع إزالة التمايز. تظهر صور التأل…

Discussion

الأجزاء الثلاثة من قناة البيض متميزة نسيجيا ومورفولوجيا ووظيفيا1،^2،3. تختلف الظهارة اختلافا كبيرا من أحد طرفي قناة البيض إلى الطرف الآخر. تهيمن الخلايا الهدبية في الطرف الوهمي/القاعي، بينما تهيمن الخلايا الإفرازية في المنطقة البرزخية1.<su…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines