Mikrodissektion og dissociation af Murine-ovidukten: Individuel segmentidentifikation og enkeltcelleisolering

Summary

En metode til mikrodissektion af museovidukten, der tillader indsamling af de enkelte segmenter, samtidig med at RNA-integriteten opretholdes, præsenteres. Derudover beskrives ikke-enzymatisk oviduktal celle dissociationsprocedure. Metoderne er egnede til efterfølgende gen- og proteinanalyse af de funktionelt forskellige oviduktale segmenter og dissocierede oviduktale celler.

Abstract

Musemodelsystemer er uovertrufne til analyse af sygdomsprocesser på grund af deres genetiske manipulerbarhed og de lave omkostninger ved eksperimentelle behandlinger. På grund af deres lille kropsstørrelse har nogle strukturer, såsom ovidukten med en diameter på 200-400 μm, vist sig at være relativt vanskelige at studere undtagen ved immunhistokemi. For nylig har immunohistokemiske undersøgelser afdækket mere komplekse forskelle i oviduktsegmenter end tidligere anerkendt; ovidukten er således opdelt i fire funktionelle segmenter med forskellige forhold mellem syv forskellige epitelcelletyper. De forskellige embryologiske oprindelser og forhold mellem epitelcelletyperne gør sandsynligvis de fire funktionelle regioner forskelligt modtagelige for sygdom. For eksempel opstår prækursorlæsioner til serøse intraepiteliale carcinomer fra infundibulum i musemodeller og fra den tilsvarende fimbriale region i den humane æggeleder. Protokollen beskrevet her beskriver en metode til mikrodissektion til at opdele ovidukten på en sådan måde, at der opnås en tilstrækkelig mængde og renhed af RNA, der er nødvendig til downstream-analyse, såsom omvendt transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) og RNA-sekventering (RNAseq). Også beskrevet er en for det meste ikke-enzymatisk vævssociationsmetode, der er egnet til flowcytometri eller enkeltcelle-RNAseq-analyse af fuldt differentierede oviduktale celler. De beskrevne metoder vil lette yderligere forskning ved hjælp af murine ovidukt inden for reproduktion, fertilitet, kræft og immunologi.

Introduction

Murinovidukten er ens i funktion og morfologi til det menneskelige ^æggeleder1. Begge består af et pseudostratificeret cilieret epitel, der består af to historisk beskrevne epitelceller: cilierede celler og sekretoriske ^celler1,2. Ovidukten har tre klassisk anerkendte segmenter: infundibulum, ampulla og isthmus. I en nylig undersøgelse, Harwalkar et al. ³ undersøgte oviduktmorfologi og genekspression, hvilket førte til udvidelsen af kategoriseringen af hjemmehørende epitelceller til syv forskellige populationer. Derudover etablerede de det ampullære-isthmus-kryds som et særskilt segment af ovidukten3. Metoden beskrevet heri, som fokuserer på infundibulum, ampulla og isthmus, kunne let udvides til også at omfatte det ampullære-istmiske ^kryds2,3. Den infundibulære region indeholder ostium eller åbning af ovidukten og omfatter den fimbriale region såvel som den proksimale stilk. Bevæger sig mod livmoderen, næste er ampulla, og derefter isthmus. Cilierede celler er mest fremtrædende i den distale ende af regionen, proksimal til æggestokken eller infundibulum, mens sekretoriske celler er mest fremtrædende i den proksimale ende eller isthmussegmentet1. I modsætning til det menneskelige æggeleder er murine-ovidukten en oprullet struktur understøttet af mesosalpinxen, en forlængelse af det brede ledbåndsperitoneum1,4. Derudover er museovidukten indkapslet i en bursal sæk, der øger sandsynligheden for oocytoverførsel til ovidukten4. Ampulla er identificeret som befrugtningsstedet, hvorfra udviklende embryoner passerer ind i isthmusen, inden de kommer ind i ^livmoderen5. Tubalsegmenter er 200-400 μm i diameter, og de længere ampullære og isthmusregioner er ca. 0,5-1,0 cm ^lange4. Ovidukten distenderne under østruscyklussen og ampulla og infundibulum er mere distensible end ^isthmus1.

Overproliferation af celler, især sekretoriske celler, karakteriserer forløberlæsioner til serøse tumorer, der findes i bækkenhulen6. Disse forløber serøse intraepitellæsioner opstår i oviduktepitelet udelukkende i fimbrialområdet; det er ukendt, hvorfor læsionsdannelse er begrænset til denne region, hvor den fremherskende celletype normalt er cilieret, ikke sekretorisk2,7,8. Regionaliteten med hensyn til normal fysiologisk funktion samt øget interesse for oviduktal oprindelse af æggestokkræft9,10,11,12,13 understreger vigtigheden af separat evaluering af oviduktsegmenterne.

Metoden, der beskrives her, beskriver indsamlingen af separate oviduktale segmenter til efterfølgende downstream-analyser af segmentspecifik genekspression og funktion af dissocierede celler. Traditionelt behandles mange væv til hel RNA-ekstraktion efter enten phenol: chloroformmetoden eller en komplet ekstraktionsmetode på kolonnen; Vi fandt imidlertid, at RNA-kvaliteten blev opretholdt, samtidig med at der blev produceret tilstrækkeligt udbytte med den beskrevne kombinationsmetode. Ved hjælp af denne metode kan meget små funktionelle segmenter af ovidukten behandles til downstream-analyser i stedet for at undersøge ovidukten som helhed, hvilket kan maskere resultater, der er repræsentative for de forskellige ^segmenter14.

Dissocierede murin oviduktale celler er sjældent blevet undersøgt ved flowcytometri, sandsynligvis på grund af det begrænsende celleudbytte fra dette væv. En tilgang til at overvinde dette problem har været at dissociere celler, dyrke dem i kultur og derefter stimulere redifferentiering in vitro for at opnå passende celletal til nedstrøms celleanalyse15,16,17,18. En begrænsning af denne tilgang er tiden ex vivo og ændret mikromiljø i kultur, som begge sandsynligvis ændrer genekspression. Der er også en antagelse om, at morfologisk redifferentiering har den samme transkriptionelle og proteomiske signatur, som var til stede i det intakte dyr. Den nuværende dissociationsmetode blev designet til at opnå det højeste antal epitelceller i en heterogen oviduktal cellepopulation, samtidig med at enkeltcelledifferentiering opretholdes. Desuden begrænser den for det meste ikke-enzymatiske tilgang sandsynligvis tabet af celleoverfladeproteiner.

Protocol

Alle dyrehåndtering og procedurer blev godkendt af University of California, Riverside institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg og var i overensstemmelse med retningslinjer fra American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture og National Institutes of Health. Den beskrevne metode anvendte C57BL/6 voksne hunmus. Alle dyr blev aflivet ved halshugning forud for vævshøst. BEMÆRK: En oversigt over protokollen, der bruger et blåt farvestof til at hjælpe…

Representative Results

Den beskrevne dissociationsprotokol giver 100.000-120.000 celler pr. Mus med pooling af begge ovidukter. Metoden er skånsom nok til at efterlade multicilierede cellegrænser intakte, hvilket giver mulighed for at skelne mellem multicilierede celler og sekretoriske celler og verificere, at fordøjelsesmetoden er skånsom nok til at forhindre dedifferentiering. Repræsentative immunfluorescensbilleder i figur 5 viser småcelleklumper efter trin 4.2.1, fastgjort i 3 minutter i 4% paraformaldeh…

Discussion

De tre segmenter af ovidukten er histologisk, morfologisk og funktionelt forskellige1,2,3. Epitelet varierer meget fra den ene ende af ovidukten til den anden. Cilierede celler dominerer i den fimbriale/infundibulære ende, mens sekretoriske celler dominerer i det istmiske ^område1. Mens denne samlede gradient er blevet anerkendt i nogen tid, har nyere arbejde afdækket flere forskelle mellem de oviductal…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines