Microdissectie en dissociatie van de murine-eileider: individuele segmentidentificatie en eencellige isolatie

Summary

Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.

Abstract

Muismodelsystemen zijn ongeëvenaard voor de analyse van ziekteprocessen vanwege hun genetische manipuleerbaarheid en de lage kosten van experimentele behandelingen. Vanwege hun kleine lichaamsgrootte zijn sommige structuren, zoals de eileider met een diameter van 200-400 μm, echter relatief moeilijk te bestuderen gebleken, behalve door immunohistochemie. Onlangs hebben immunohistochemische studies complexere verschillen in eileidersegmenten blootgelegd dan eerder werd erkend; de eileider is dus verdeeld in vier functionele segmenten met verschillende verhoudingen van zeven verschillende epitheelceltypen. De verschillende embryologische oorsprong en verhoudingen van de epitheelceltypen maken de vier functionele regio’s waarschijnlijk differentieel vatbaar voor ziekten. Voorloperlaesies van sereuze intra-epitheliale carcinomen ontstaan bijvoorbeeld uit het infundibulum in muismodellen en uit het overeenkomstige fimboriale gebied in de menselijke eileider. Het hier beschreven protocol beschrijft een methode voor microdissectie om de eileider zodanig te verdelen dat er voldoende hoeveelheid en zuiverheid van RNA ontstaat die nodig is voor downstream-analyse, zoals reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) en RNA sequencing (RNAseq). Ook wordt een meestal niet-enzymatische weefseldissociatiemethode beschreven die geschikt is voor flowcytometrie of eencellige RNAseq-analyse van volledig gedifferentieerde eileidercellen. De beschreven methoden zullen verder onderzoek met behulp van de muizenne eileider op het gebied van voortplanting, vruchtbaarheid, kanker en immunologie vergemakkelijken.

Introduction

De eileider van de muriene lijn is qua functie en morfologie vergelijkbaar met de menselijke ^eileider1. Beide bestaan uit een pseudostraïstisch trilhaarepitheel, bestaande uit twee historisch beschreven epitheelbewonende cellen: trilhaarcellen en secretoire ^cellen1,2. De eileider heeft drie klassiek erkende segmenten: het infundibulum, de ampulla en de landengte. In een recente studie, Harwalkar et al. ³ onderzocht ovöcusmorfologie en genexpressie die leidden tot de uitbreiding van de categorisatie van residente epitheelcellen tot zeven verschillende populaties. Bovendien stelden ze de ampullaire-landengte-overgang vast als een apart segment van de ^eileider3. De hierin beschreven methode, die zich richt op het infundibulum, ampulla en landengte, kan gemakkelijk worden uitgebreid met de ampullaire-isthmische ^overgang2,3. Het infundibulaire gebied bevat het ostium, of de opening van de eileider, en omvat het fimbriale gebied en de proximale stengel. Als je naar de baarmoeder gaat, is de volgende het ampulla en dan de landengte. Trilhaarcellen zijn het meest prominent in het distale uiteinde van het gebied, proximaal aan de eierstok of infundibulum, terwijl secretoire cellen het meest prominent zijn in het proximale uiteinde of landengtesegment1. In tegenstelling tot de menselijke eileider is de eileider een opgerolde structuur die wordt ondersteund door de mesosalpinx, een uitbreiding van het brede ligament ^{peritoneum1,4}. Bovendien is de eileider van de muis ingepakt in een bursale zak die de kans op oöcytoverdracht in de eileider ^verhoogt4. De ampulla wordt geïdentificeerd als de locatie van bevruchting, van waaruit zich ontwikkelende embryo’s in de landengte overgaan voordat ze de baarmoeder ^binnengaan5. Tubale segmenten hebben een diameter van 200-400 μm en de langere ampullen- en landengtegebieden zijn ongeveer 0,5-1,0 cm ^lang4. De eileider zwelt op tijdens de oestruscyclus en de ampulla en infundibulum zijn uitzetbaarder dan de ^landengte1.

Over proliferatie van cellen, vooral secretoire cellen, karakteriseren voorloperlaesies van sereuze tumoren in de bekkenholte6. Deze voorloper sereuze intra-epitheliale laesies ontstaan in het eileiderepitheel uitsluitend in het fimboriale gebied; het is onbekend waarom de vorming van laesies beperkt is tot dit gebied waar normaal gesproken het overheersende celtype wordt geciliteerd, niet secretoir2,7,8. De regionaliteit in termen van normale fysiologische functie, evenals verhoogde interesse in de eileideroorsprong van eierstokkanker9,10,11,12,13, onderstreept het belang van afzonderlijke evaluatie van de eileidersegmenten.

De hier beschreven methode beschrijft de verzameling van afzonderlijke eileidersegmenten voor daaropvolgende downstream-analyses van segmentspecifieke genexpressie en functie van gedissocieerde cellen. Traditioneel worden veel weefsels verwerkt voor hele RNA-extractie volgens de fenol: chloroform-methode of een volledige extractiemethode op de kolom; we vonden echter dat de RNA-kwaliteit behouden bleef terwijl er voldoende opbrengst werd geproduceerd met de beschreven combinatiemethode. Met behulp van deze methode kunnen zeer kleine functionele segmenten van de eileider worden verwerkt voor stroomafwaartse analyses in plaats van de eileider als geheel te onderzoeken, wat resultaten kan maskeren die representatief zijn voor de verschillende ^segmenten14.

Gedissocieerde muriene eileidercellen zijn zelden onderzocht door flowcytometrie, hoogstwaarschijnlijk vanwege de beperkende celopbrengst van dit weefsel. Een benadering om dit probleem te overwinnen was om cellen te dissociëren, ze in cultuur te laten groeien en vervolgens re-differentiatie in vitro te stimuleren om geschikte celnummers te verkrijgen voor downstream celanalyse15,16,17,18. Een beperking van deze benadering is de tijd ex vivo en veranderde micro-omgeving in cultuur, die beide waarschijnlijk de genexpressie veranderen. Er is ook een aanname dat morfologische redifferentiatie dezelfde transcriptionele en proteomische signatuur heeft als bij het intacte dier. De huidige dissociatiemethode is ontworpen om het hoogste aantal epitheelcellen in een heterogene eileidercelpopulatie te bereiken met behoud van eencellige differentiatie. Verder beperkt de meestal niet-enzymatische benadering waarschijnlijk het verlies van celoppervlakeiwitten.

Protocol

Alle dierbehandeling en -procedures werden goedgekeurd door de University of California, Riverside institutional animal care and use committee en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de American Association for Laboratory Animal Care, het Amerikaanse ministerie van Landbouw en de National Institutes of Health. De beschreven methode maakte gebruik van C57BL/6 volwassen, vrouwelijke muizen. Alle dieren werden geëuthanaseerd door onthoofding voorafgaand aan het oogsten van weefsel. OP…

Representative Results

Het beschreven dissociatieprotocol levert 100.000-120.000 cellen per muis op met pooling van beide eileiders. De methode is zacht genoeg om multi-ciliated celgrenzen intact te laten, waardoor een onderscheid mogelijk is tussen multi-ciliated cellen en secretoire cellen, en wordt gecontroleerd of de verteringsmethode zacht genoeg is om de-differentiatie te voorkomen. Representatieve immunofluorescentiebeelden in figuur 5 tonen kleincellige klonten na stap 4.2.1, gedurende 3 minuten gefixeerd …

Discussion

De drie segmenten van de eileider zijn histologisch, morfologisch en functioneel ^{verschillend1,2,3}. Het epitheel varieert sterk van het ene uiteinde van de eileider naar het andere. Trilhaarcellen domineren aan het fimbardale/infundibulaire uiteinde, terwijl secretoire cellen domineren in het istmische ^gebied1. Hoewel deze algemene gradiënt al enige tijd wordt erkend, heeft recent werk meer verschillen t…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines