Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

Summary

Viene presentato un metodo per la microdissezione dell’ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l’integrità dell’RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.

Abstract

I sistemi di modelli murini non hanno eguali per l’analisi dei processi patologici a causa della loro manipolabilità genetica e del basso costo dei trattamenti sperimentali. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni corporee, alcune strutture, come l’ovidotto con un diametro di 200-400 μm, si sono dimostrate relativamente difficili da studiare se non con l’immunoistochimica. Recentemente, studi immunoistochimici hanno scoperto differenze più complesse nei segmenti dell’ovidotto di quanto precedentemente riconosciuto; quindi, l’ovidotto è diviso in quattro segmenti funzionali con rapporti diversi di sette distinti tipi di cellule epiteliali. Le diverse origini embriologiche e i rapporti dei tipi di cellule epiteliali probabilmente rendono le quattro regioni funzionali differenzialmente suscettibili alle malattie. Ad esempio, le lesioni precursori dei carcinomi intraepiteliali sierosi derivano dall’infundibulum nei modelli murini e dalla corrispondente regione fimbriale nella tuba di Falloppio umana. Il protocollo qui descritto descrive un metodo per la microdissezione per suddividere l’ovidotto in modo tale da produrre una quantità e una purezza sufficienti di RNA necessarie per l’analisi a valle come la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) e il sequenziamento dell’RNA (RNAseq). Viene inoltre descritto un metodo di dissociazione tissutale per lo più non enzimatico appropriato per la citometria a flusso o l’analisi RNAseq a singola cellula di cellule oviduttali completamente differenziate. I metodi descritti faciliteranno ulteriori ricerche utilizzando l’ovidotto murino nel campo della riproduzione, della fertilità, del cancro e dell’immunologia.

Introduction

L’ovidotto murino è simile per funzione e morfologia alla tuba di Falloppio ^umana1. Entrambi sono costituiti da un epitelio ciliato pseudostratificato, costituito da due cellule residenti epiteliali storicamente descritte: cellule ciliate e cellule ^{secretorie1,2}. L’ovidotto ha tre segmenti classicamente riconosciuti: l’infundibulum, l’ampolla e l’istmo. In un recente studio, Harwalkar et al. ³ hanno studiato la morfologia dell’ovidotto e l’espressione genica che ha portato all’espansione della categorizzazione delle cellule epiteliali residenti a sette popolazioni distinte. Inoltre, hanno stabilito la giunzione ampollare-istmo come un segmento distinto dell’ovidotto3. Il metodo qui descritto, che si concentra sull’infundibulum, l’ampolla e l’istmo, potrebbe essere facilmente esteso per includere anche la giunzione ampollare-istmmica2,3. La regione infundibolare contiene l’ostio, o apertura dell’ovidotto, e comprende la regione fimbriale e il gambo prossimale. Spostandosi verso l’utero, il prossimo è l’ampolla, e poi l’istmo. Le cellule ciliate sono più prominenti nell’estremità distale della regione, prossimali all’ovaio o all’infundibulum, mentre le cellule secretorie sono più prominenti nell’estremità prossimale o nel segmento dell’istmo1. A differenza della tuba di Falloppio umana, l’ovidotto murino è una struttura a spirale sostenuta dal mesosalpinx, un’estensione del legamento largo peritoneo1,4. Inoltre, l’ovidotto di topo è racchiuso in un sacco bursale che aumenta la probabilità di trasferimento di ovociti nell’ovidotto4. L’ampolla è identificata come il luogo della fecondazione, da cui gli embrioni in via di sviluppo passano nell’istmo prima di entrare nell’utero5. I segmenti tubarici hanno un diametro di 200-400 μm e le regioni ampollari e istmo più lunghe sono lunghe circa 0,5-1,0 ^cm4. L’ovidotto si distende durante il ciclo estrale e l’ampolla e l’infundibulum sono più distensibili dell’istmo1.

L’eccessiva proliferazione delle cellule, in particolare le cellule secretorie, caratterizza le lesioni precursori dei tumori sierosi presenti nella cavità ^pelvica6. Queste lesioni intraepiteliali sierose precursori insorgono nell’epitelio dell’ovidotto esclusivamente nella regione fimbriale; non è noto il motivo per cui la formazione di lesioni è limitata a questa regione dove normalmente il tipo cellulare predominante è ciliato, non secretorio2,7,8. La regionalità in termini di normale funzione fisiologica, nonché l’accresciuto interesse per l’origine oviduttale del carcinoma ovarico9,10,11,12,13, sottolinea l’importanza di una valutazione separata dei segmenti dell’ovidotto.

Il metodo qui descritto descrive in dettaglio la raccolta di segmenti oviduttali separati per le successive analisi a valle dell’espressione genica specifica del segmento e della funzione delle cellule dissociate. Tradizionalmente, molti tessuti vengono elaborati per l’estrazione dell’RNA intero seguendo il metodo del cloroformio fenolo: o un metodo di estrazione completo su colonna; tuttavia, abbiamo scoperto che la qualità dell’RNA è stata mantenuta producendo una resa sufficiente con il metodo di combinazione descritto. Utilizzando questo metodo, segmenti funzionali molto piccoli dell’ovidotto possono essere elaborati per analisi a valle piuttosto che indagare l’ovidotto nel suo complesso, il che può mascherare risultati rappresentativi dei diversi ^segmenti14.

Le cellule oviduttali murine dissociate sono state raramente studiate mediante citometria a flusso, molto probabilmente a causa della resa cellulare limitante di questo tessuto. Un approccio per superare questo problema è stato quello di dissociare le cellule, farle crescere in coltura e quindi stimolare la ri-differenziazione in vitro per ottenere numeri di cellule appropriati per l’analisi cellulare a valle15,16,17,18. Una limitazione a questo approccio è il tempo ex vivo e il microambiente alterato in coltura, entrambi i quali probabilmente cambiano l’espressione genica. C’è anche l’ipotesi che il ridis differenziato morfologico abbia la stessa firma trascrizionale e proteomica presente nell’animale intatto. L’attuale metodo di dissociazione è stato progettato per ottenere il maggior numero di cellule epiteliali in una popolazione eterogenea di cellule oviduttali, mantenendo la differenziazione a singola cellula. Inoltre, l’approccio per lo più non enzimatico probabilmente limita la perdita di proteine di superficie cellulare.

Protocol

Tutte le procedure e la manipolazione degli animali sono state approvate dall’Università della California, dal comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali di Riverside ed erano conformi alle linee guida dell’American Association for Laboratory Animal Care, del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti e del National Institutes of Health. Il metodo descritto ha utilizzato C57BL/6 topi adulti, femmine. Tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia per decapitazione prima della raccolta dei tessuti…

Representative Results

Il protocollo di dissociazione descritto produce 100.000-120.000 cellule per topo con raggruppamento di entrambi gli ovidotti. Il metodo è abbastanza delicato da lasciare intatti i bordi delle cellule multi-ciliate, consentendo una distinzione tra cellule multi-ciliate e cellule secretorie e verificando che il metodo di digestione sia abbastanza delicato da prevenire la de-differenziazione. Le immagini rappresentative di immunofluorescenza nella Figura 5 mostrano grumi di piccole cellule do…

Discussion

I tre segmenti dell’ovidotto sono istologicamente, morfologicamente e funzionalmente ^{distinti1,2,3}. L’epitelio varia notevolmente da un’estremità all’altra dell’ovidotto. Le cellule ciliate dominano all’estremità fibriale/infundibolare, mentre le cellule secretorie dominano nella regione istmica1. Mentre questo gradiente complessivo è stato riconosciuto per qualche tempo, lavori recenti hanno scoperto …

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines