マウス卵管の微小解剖と解離:個体セグメントの同定と単一細胞単離

Summary

RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。

Abstract

マウスモデルシステムは、その遺伝的操作性と実験的治療の低コストのために、疾患プロセスの分析には比類のないものです。しかし、その小さな体の大きさのために、直径200〜400μmの卵管のようないくつかの構造は、免疫組織化学によってを除いて研究することが比較的困難であることが証明されている。最近、免疫組織化学的研究は、以前に認識されていたよりも卵管セグメントのより複雑な違いを明らかにした。したがって、卵管は、7つの異なる上皮細胞型の異なる比率を有する4つの機能セグメントに分割される。上皮細胞型の異なる発生学的起源および比率は、4つの機能領域を疾患に対して差次的に感受性にする可能性が高い。例えば、漿液性上皮内癌の前駆体病変は、マウスモデルにおける眼底内およびヒト卵管内の対応するフィンブリア領域から生じる。ここで説明するプロトコルは、逆転写定量PCR(RT-qPCR)やRNAシーケンシング(RNAseq)などの下流分析に必要な十分な量と純度のRNAを得られるような方法で卵管を細分化するマイクロダイセクションの方法を詳述しています。また、完全に分化した卵管細胞のフローサイトメトリーまたは単一細胞RNAseq分析に適した、ほとんどが非酵素的な組織解離法も記載されている。記載された方法は、生殖、生殖能力、癌、および免疫学の分野におけるマウス卵管を利用するさらなる研究を容易にするであろう。

Introduction

マウスの卵管は、機能と形態が人間の卵管と似ています¹。どちらも擬似層状繊毛上皮からなり、歴史的に記述された2つの上皮常駐細胞、繊毛細胞と分泌細胞^{からなる1,2}。卵管には、古典的に認識された3つのセグメント、すなわち眼底、アンプラ、地峡があります。最近の研究では、Harwalkarらが^3は、卵管形態および遺伝子発現を調査し、常在上皮細胞の分類を7つの異なる集団に拡大させた。さらに、彼らは卵管の別個のセグメントとしてアンプラリー – 地峡接合部を確立した³。眼底内、アンプラ、および地峡に焦点を当てた本明細書に記載の方法は、アンプラ – 地峡接合部も含むように容易に拡張することができ^た2,3。眼底領域は、オスチウム、または卵管の開口部を含み、フィンブリア領域ならびに近位茎を含む。子宮に向かって移動すると、次はアンプラ、次に地峡です。繊毛化細胞は、卵巣または眼底の近位にある領域の遠位端で最も顕著であり、一方、分泌細胞は近位端または地峡セグメントで最も顕著である¹。ヒトの卵管とは異なり、マウス卵管は、広い靭帯腹膜の延長であるメソサルピンクスによって支持されたコイル構造である^1,4。さらに、マウス卵管は滑液包嚢に包まれており、卵母細胞が卵管に移入する可能性が高まります⁴。アンプラは受精の場所として同定され、発達中の胚は子宮に入る前に地峡に入る⁵。管状セグメントの直径は200〜400μmで、より長いアンプラリーおよび地峡領域の長さは約0.5〜1.0cmです⁴。卵管は発情周期の間に収縮し、アンプラと眼底は地峡よりも伸展性が高い¹。

細胞、特に分泌細胞の過剰増殖は、骨盤腔内に見出される漿液性腫瘍の前駆病変を特徴付け^る6。これらの前駆体漿液性上皮内病変は、卵管上皮においてのみ、フィンブリア領域においてのみ生じる。病変形成が、通常、優勢な細胞型が分泌型ではなく繊毛化されるこの領域に限定される理由は不明である^2,7,8。正常な生理機能に関する地域性、ならびに卵巣癌の卵管起源に対する関心の高まり9,10,11,12,13は、卵管セグメントの別個の評価の重要性を強調する。

ここで説明する方法は、解離した細胞のセグメント特異的遺伝子発現および機能のその後の下流分析のための別個の卵管セグメントの収集を詳述する。伝統的に、多くの組織は、フェノールのいずれかに続いて全RNA抽出のために処理される:クロロホルム法またはオンカラム完全抽出法;しかし、RNAの品質は維持され、記載された併用法では十分な収率が得られていることを見出した。この方法を利用すると、卵管の非常に小さな機能セグメントを、卵管全体を調査するのではなく、下流分析のために処理することができ、異なるセグメントを表す結果をマスクすることができる¹⁴。

解離したマウス卵管細胞は、フローサイトメトリーによって調査されることはめったになく、おそらくこの組織からの細胞収量が限られているためである。この問題を克服するための1つのアプローチは、細胞を解離させ、培養中で増殖させ、次いでインビトロで再分化を刺激して、下流の細胞分析に適した細胞数を得ることであった^15,16,17,18。このアプローチの限界は、培養中の時間エクスビボおよび変化した微小環境であり、どちらも遺伝子発現を変化させる可能性が高い。形態学的再分化は、無傷の動物に存在していたのと同じ転写的およびプロテオミクス的特徴を有するという仮定もある。現在の解離法は、単一細胞分化を維持しながら、異種卵管細胞集団において最多の上皮細胞数を達成するように設計した。さらに、ほとんどが非酵素的アプローチは、細胞表面タンパク質の損失を制限する可能性が高い。

Protocol

すべての動物の取り扱いと手順は、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、米国実験動物ケア協会、米国農務省、および国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。記載された方法は、C57BL/6成体、雌マウスを利用した。全ての動物を、組織採取前に断頭により安楽死させた。 注:青色染料を使用して卵管の効率的…

Representative Results

記載された解離プロトコールは、両方の卵管のプールを有するマウス当たり100,000〜120,000個の細胞を生じる。この方法は、多繊毛細胞の境界をそのまま残すのに十分なほど穏やかであり、多繊毛細胞と分泌細胞の区別を可能にし、消化法が脱分化を防ぐのに十分穏やかであることを確認する。図5の代表的な免疫蛍光画像は、ステップ4.2.1に続く小細胞凝集塊を、4%パラホ…

Discussion

卵管の3つのセグメントは、組織学的、形態学的、および機能的に異なっている^1,2,3。上皮は卵管の一方の端から他方の端まで大きく変化する。繊毛細胞はフィンブリア/眼底末端で優勢であり、分泌細胞は地峡領域で優勢です¹。この全体的な勾配はしばらく前から認識されていましたが、最近の研究では?…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines