뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리
Summary
RNA 무결성을 유지하면서 개별 세그먼트의 수집을 허용하는 마우스 배반의 미세 절제 방법이 제시된다. 또한, 비효소 성 배관 세포 해리 절차가 설명된다. 이 방법은 기능적으로 상이한 배반 분과 및 해리된 배관 세포의 후속 유전자 및 단백질 분석에 적합합니다.
Abstract
마우스 모델 시스템은 유전적 절만성과 실험 적 치료의 저렴한 비용으로 인해 질병 프로세스의 분석에 대한 타의 추종을 불허합니다. 그러나, 그들의 작은 체내에서, 200-400 μm의 직경을 가진 oviduct와 같은 몇몇 구조물은 면역작용화학을 제외하고는 연구하기 상대적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 최근, 면역히토화학 연구는 이전에 인식된 것보다 oviduct 세그먼트에 있는 더 복잡한 다름을 발견했습니다; 따라서, oviduct는 7개의 명백한 상피 세포 모형의 상이한 비율을 가진 4개의 기능적인 세그먼트로 분할됩니다. 상피 세포 모형의 상이한 배아 기원 및 비율은 가능성이 4개의 기능적인 지구가 질병에 분화하기 쉽게 만듭니다. 예를 들어, 전구체 병변은 마우스 모델의 농가 에서 발생하며 인간 나팔관의 상응하는 피모브리알 영역에서 발생한다. 여기서 설명된 프로토콜은 역전사-정량PCR(RT-qPCR) 및 RNA 시퀀싱(RNAseq)과 같은 다운스트림 분석에 필요한 RNA의 충분한 양및 순도를 산출하는 방식으로 마이크로절이 배관을 세분화하는 방법을 상세히 기술한다. 또한 완전히 분화된 난관 세포의 유동 세포측정 또는 단일 세포 RNAeq 분석에 적합한 대부분 비 효소 조직 해리 방법이 기재되어 있다. 설명된 방법은 생식, 불임, 암 및 면역학 분야에서 뮤린 배관을 활용하는 추가 연구를 촉진할 것입니다.
Introduction
뮤린 배관은 인간 나팔관1과 기능 및 형태학에서 유사합니다. 둘 다 역사적으로 설명된 두 개의 상피 상피 상피 세포로 구성된 의사 섬광 상부로 구성됩니다: 양모 세포 및 분비 세포1,2. oviduct는 세 가지 고전적으로 인식 세그먼트가 있습니다 : fundibulum, 암풀라, 그리고 isthmus. 최근 연구에서, 하와카르 외. 3 7개의 명백한 인구로 상피 세포의 분류의 확장으로 이끌어 내는 oviduct 형태학 및 유전자 발현을 조사했습니다. 또한, 그들은 oviduct3의 뚜렷한 세그먼트로 ampullary-isthmus 접합을 설립했다. 본 명세서에서 기재된 방법은, 농가, 암풀라 및 isthmus에 초점을 맞추고, ampullary-isthmic 접합뿐만 아니라 2,3을 포함하도록 쉽게 확장될 수 있었다. 기금 부족 영역은 오시덕트의 오스티움 또는 개방을 포함하고 있으며, 근접 줄기뿐만 아니라 피모브리알 영역을 포함한다. 자궁쪽으로 이동, 다음 암풀라, 그리고 isthmus입니다. Ciliated 세포는 이 지역의 단부 끝에서 가장 두드러지며, 난소에 근접하거나, 또는 fundibulum이 있는 반면, 분비 세포는 근위 말쪽 또는 isthmus 세그먼트1에서 가장 두드러집니다. 인간 나팔관과는 달리, 뮤린 배관은 메소살핀스, 넓은 인대 복막1,4의 연장에 의해 지원되는 코일 구조입니다. 또한, 마우스 oviduct는 oviduct4로 oocyte 전송의 가능성을 증가 bursal 낭에 싸여있다. 암풀라는 자궁5에 들어가기 전에 개발 배아가 isthmus로 통과하는 수정의 위치로 확인됩니다. 관 세그먼트는 직경 200-400 μm이고 더 긴 ampullary 및 isthmus 영역은 길이가 약 0.5-1.0cm입니다4. oviduct는 에스스트라이스트 사이클 동안 불협화음과 암풀라와 인펀드티불룸은 isthmus1보다 더 현명하지 못합니다.
세포의 증식, 특히 분비 세포는 골반 구멍에서 발견되는 장종양에 전구체 병변을 특성화합니다6. 이러한 전구체 장피상피성 병변은 피모브리알 영역에서만 난소 상피에서 발생합니다. 병변 형성이 일반적으로 우세한 세포 유형이 분모가 아닌 분비2,7,8이 되는 이 부위로 제한되는 이유는 알려지지 않았다. 정상적인 생리적 기능 측면에서 지역성은 난소암의 난소 기원에 대한 관심이 높아졌을 뿐만 아니라, 난소암의 분비성 기원에 대한 관심이 높아지고 있다9,10,11,12,13, 난소 세그먼트의 별도 평가의 중요성을 강조한다.
여기서 설명된 방법은 분할 특이적 유전자 발현 및 해리된 세포의 기능의 후속 다운스트림 분석을 위한 별도의 배반 세그먼트의 수집을 자세히 설명합니다. 전통적으로, 많은 조직은 페놀에 따라 전체 RNA 추출을 위해 처리됩니다: 클로로폼 방법 또는 온컬럼 완전 추출 방법; 그러나, 우리는 RNA 품질이 설명된 조합 방법으로 충분한 수율을 생성하는 동안 유지되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 방법을 활용하면, oviduct의 매우 작은 기능 세그먼트는 서로 다른 세그먼트를 대표하는 결과를 마스크 할 수있는 전체 oviduct을 조사하는 대신 다운스트림 분석을 위해 처리 될 수있다14.
해리된 뮤린 오비덕탈 세포는 이 조직에서 세포 수율을 제한하기 때문에 혈류 세포측정에 의해 거의 조사되지 않았습니다. 이 문제를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 세포를 해리화하고, 배양에서 성장한 다음, 다운스트림 세포 분석을 위한 적절한 세포 수를 얻기 위해 시험관에서 재분화를 자극하는 것입니다15,16,17,18. 이 접근법에 대한 제한은 배양에서 전 생체 및 변경 된 미세 환경이며, 둘 다 유전자 발현을 바꿀 가능성이 있습니다. 또한 형태학적 재분화가 그대로 동물에 존재하는 것과 동일한 전사 및 프로테오믹 시그니처를 가지고 있다는 가정도 있습니다. 현재 해리 방법은 단일 세포 분화를 유지하면서 이성수 배반 세포 집단에서 가장 많은 상피 세포를 달성하도록 설계되었습니다. 추가, 대부분 비 효소 접근은 가능성이 세포 표면 단백질의 손실을 제한.
Protocol
Representative Results
Discussion
oviduct의 세 세그먼트는 조직학적으로, 형태학적으로, 및 기능적으로 구별1,2,3이다. 상피는 oviduct의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 크게 다릅니다. Ciliated 세포는 fimbrial/fundibular 끝에 지배, 분비 세포는 isthmic 지역에서 지배 하는 동안1. 이 전반적인 그라데이션은 한동안 인정되었지만, 최근 연구는 oviductal 세그먼?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425)에 대한 DoD 획기적인 상에 의해 부분적으로 지원되었다. KCR은 교내 펠로우십에 의해 부분적으로 지원되었다: Pease 암 전 박사 과정 펠로우십과 메리 갈빈 부담 생물 의학 과학 및 캘리포니아 대학, 리버 사이드, 교내 상에서 박사 전 펠로우십: 대학원 위원회 펠러십 위원회 논문 연구 보조금 및 대학원 부문 논문 연도 프로그램 상. 저자는 길리안 M. 라이트와 알리사 M. 쿠마리에게 이 방법의 초기 문제 해결에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
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