Microdissection et dissociation de l’oviducte murin : identification de segment individuel et isolement unicellulaire

Résumé

Une méthode de microdissection de l’oviducte de souris qui permet la collecte des segments individuels tout en maintenant l’intégrité de l’ARN est présentée. En outre, une procédure de dissociation des cellules oviductales non enzymatiques est décrite. Les méthodes sont appropriées pour l’analyse ultérieure des gènes et des protéines des segments oviductaux fonctionnellement différents et des cellules oviductales dissociées.

Résumé

Les systèmes de modèles murins sont inégalés pour l’analyse des processus pathologiques en raison de leur manipulabilité génétique et du faible coût des traitements expérimentaux. Cependant, en raison de leur petite taille corporelle, certaines structures, telles que l’oviducte d’un diamètre de 200 à 400 μm, se sont avérées relativement difficiles à étudier, sauf par immunohistochimie. Récemment, des études immunohistochimiques ont révélé des différences plus complexes dans les segments d’oviductes que ce qui était reconnu auparavant; ainsi, l’oviducte est divisé en quatre segments fonctionnels avec des rapports différents de sept types de cellules épithéliales distinctes. Les différentes origines embryologiques et les ratios des types de cellules épithéliales rendent probablement les quatre régions fonctionnelles différentiellement sensibles à la maladie. Par exemple, les lésions précurseurs des carcinomes intraépithéliaux séreux proviennent de l’infundibulum dans les modèles murins et de la région fimbriale correspondante dans la trompe de Fallope humaine. Le protocole décrit ici détaille une méthode de microdissection pour subdiviser l’oviducte de manière à produire une quantité et une pureté suffisantes d’ARN nécessaires à l’analyse en aval, telles que la TRANSCRIPTION inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) et le séquençage de l’ARN (RNAseq). On décrit également une méthode de dissociation tissulaire principalement non enzymatique appropriée pour la cytométrie en flux ou l’analyse RNAseq unicellulaire de cellules oviductales entièrement différenciées. Les méthodes décrites faciliteront la poursuite des recherches utilisant l’oviducte murin dans le domaine de la reproduction, de la fertilité, du cancer et de l’immunologie.

Introduction

L’oviducte murin a une fonction et une morphologie similaires à celles de la trompe de Fallope ^humaine1. Les deux sont constitués d’un épithélium cilié pseudostratifié, composé de deux cellules résidentes épithéliales décrites historiquement: les cellules ciliées et les cellules sécrétoires1,2. L’oviducte a trois segments classiquement reconnus: l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme. Dans une étude récente, Harwalkar et al. ³ a étudié la morphologie des oviductes et l’expression des gènes conduisant à l’expansion de la catégorisation des cellules épithél....

Protocole

Toutes les manipulations et procédures de manipulation et d’utilisation des animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Riverside et étaient conformes aux directives de l’American Association for Laboratory Animal Care, du département de l’Agriculture des États-Unis et des National Institutes of Health. La méthode décrite utilisait des souris femelles adultes C57BL/6. Tous les animaux ont été euthanasiés par décapitation avant la récolte des tissus.

REMARQUE: Un aperçu du protocole, qui utilise un colorant bleu pour aider à la dissection efficace et au débobin....

Résultats

Le protocole de dissociation décrit donne 100 000 à 120 000 cellules par souris avec mise en commun des deux oviductes. La méthode est suffisamment douce pour laisser intactes les bordures cellulaires multi-ciliées, permettant une distinction entre les cellules multi-ciliées et les cellules sécrétoires, et vérifiant que la méthode de digestion est suffisamment douce pour empêcher la dédifférenciation. Les images représentatives de l’immunofluorescence de la figure 5 montrent des amas de peti.......

Discussion

Les trois segments de l’oviducte sont histologiquement, morphologiquement et fonctionnellement ^{distincts1,2,3}. L’épithélium varie considérablement d’une extrémité de l’oviducte à l’autre. Les cellules ciliées dominent à l’extrémité fimbriale/infundibulaire, tandis que les cellules sécrétoires dominent dans la région isthmique1. Bien que ce gradient global soit reconnu depuis un certain temps, des travaux .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mélange de billes en acier inoxydable de 0,5 mm	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 avec SSB14B de 1,4 mm, stérilisé
de 1,4 mm Mélange de billes d’acier inoxydable	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 avec SSB05 de 0,5 mm, stérilisé
1X Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline A, pH 7,4 (DPBS)	Gibco	21600-010
Aiguille BD 25G		et stérile 305122
Boîtes de Pétri stériles de 60 mm	Corning	430166
70 &mu ; Mailles cellulaires	Agilent	Fisherbrand 22-636-548
Agilent Eucaryote ARN total 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Homogénéisateur	de tissus Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A7906
Froid plaque/emballage/surface au choix	N/A	N/A	Maintenu à -20 ° ; C pour dissection
Cire dentaire	Polysciences Inc.	403
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)/ Ham' s F12	Corning	10-090-CV	Préparer le milieu de dissection : DMEM/ Ham' s F12, 10 % FBS, 25 mM Hepes, 1 % Pen-Strep
Sérum fœtal bovin	Corning	35-015CV
Pince à pointe fine au choix	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Images de validation immunocytochimique
Chèvre anti-souris IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Images de validation immunocytochimique
Chèvre anti-lapin IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Images de validation immunocytochimique
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Technologies de signalisation cellulaire	4082S	Images de validation immunocytochimique
Microscope composé inversé	Keyence BZ-X700
Souris anti-souris Occludin	Invitrogen	33-1500	Tampon
dissociation non enzymatique	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L de glucose, 0,4 % BSA, 1X DPBS
Macro-maille en nylon 1 mm x 1 mm Thomas	Scientific	1210U04
Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	P-6148	Images de validation immunocytochimique
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Réactif anti-effacement Prolong Gold	Cell Signaling Technologies	9071S	Images de validation immunocytochimique : milieu de montage anti-décoloration
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Préparer le milieu de digestion de la pronase : 0,15 % de pronase dans le DMEM/F12 de Ham, stérile
Iodure de propidium	Roche	11 348 639 001	Images de validation de la viabilité
Lapin anti-souris Acétylée-tubuline	Abcam	ab179484	Images de validation immunocytochimique
Tampon de lyse RBC	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilisé pour la purification sur colonne dans le texte Ciseaux de
microdissection à ressort	Roboz Surgical	RS-5610
Pipettes à bulbe stériles de 3 mL	Globe Scientific	137135
Bleu de toluidine	Alfa Aesar	J66015	Préparer une solution de bleu de toluidine : 1 % dans 1X DPBS, stérile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Images de validation immunocytochimique ; 0,1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 % Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Images de validation immunocytochimique
Réactif d’extraction d’ARN Trizol	Invitrogen	15596026	Appelé réactif d’extraction d’ARN. De l’eau sans nucelase, du chloroforme et de l’isoproponal sont nécessaires en complément de l’extraction du trizol selon les directives du fabricant

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