Микродиссекция и диссоциация мышиного яйцевода: идентификация отдельных сегментов и изоляция одиночных клеток

Summary

Представлен способ микродиссекции яйцевода мыши, позволяющий собирать отдельные сегменты при сохранении целостности РНК. Кроме того, описана процедура неферментативной диссоциации клеток яйцевода. Методы подходят для последующего генного и белкового анализа функционально различных сегментов яйцеводов и диссоциированных клеток яйцевода.

Abstract

Мышиные модельные системы не имеют себе равных для анализа процессов заболевания из-за их генетической манипулируемости и низкой стоимости экспериментального лечения. Однако из-за их небольшого размера тела некоторые структуры, такие как яйцевод диаметром 200-400 мкм, оказались относительно трудными для изучения, кроме как с помощью иммуногистохимии. В последнее время иммуногистохимические исследования выявили более сложные различия в сегментах яйцеводов, чем было признано ранее; таким образом, яйцевод делится на четыре функциональных сегмента с различным соотношением семи различных типов эпителиальных клеток. Различное эмбриологическое происхождение и соотношение типов эпителиальных клеток, вероятно, делают четыре функциональные области дифференцированно восприимчивыми к болезням. Например, поражения-предшественники серозных интраэпителиальных карцином возникают из инфундибулума в мышиных моделях и из соответствующей фимбриальной области в фаллопиевой трубе человека. Протокол, описанный здесь, детализирует метод микродиссекции для разделения яйцевода таким образом, чтобы получить достаточное количество и чистоту РНК, необходимых для последующего анализа, такого как обратная транскрипционно-количественная ПЦР (RT-qPCR) и секвенирование РНК (RNAseq). Также описан в основном неферментативный метод диссоциации тканей, подходящий для проточной цитометрии или одноклеточного анализа RNAseq полностью дифференцированных клеток яйцевода. Описанные методы будут способствовать дальнейшим исследованиям с использованием мышиного яйцевода в области репродукции, фертильности, рака и иммунологии.

Introduction

Мышиный яйцевод похож по функциям и морфологии на человеческую фаллопиеву ^трубу1. Оба состоят из псевдостратифицированного реснитчатого эпителия, состоящего из двух исторически описанных эпителиальных резидентных клеток: реснитчатых клеток и секреторных ^{клеток1,2}. Яйцевод имеет три классически признанных сегмента: инфундибулум, ампулла и перешеек. В недавнем исследовании Harwalkar et al. ³ исследовали морфологию яйцеводов и экспрессию генов, что привело к расширению категоризации резидентных эпителиальных клеток до семи различных популяций. Кроме того, они установили ампуллярно-перешеечное соединение как отдельный сегмент яйцевода3. Способ, описанный в настоящем описании, который фокусируется на инфундибуле, ампуле и перешейке, может быть легко расширен, чтобы включить ампуллярно-истмическое соединение, а ^{также2,3}. Инфундибулярная область содержит остиум, или отверстие яйцевода, и включает в себя фимбриальную область, а также проксимальный стебель. Двигаясь в сторону матки, далее идет ампулла, а затем перешеек. Реснитчатые клетки наиболее заметны в дистальном конце области, проксимально к яичнику или инфундибулу, в то время как секреторные клетки наиболее заметны в проксимальном конце или сегменте ^{перешейка1}. В отличие от человеческой фаллопиевой трубы, мышиный яйцевод представляет собой спиральную структуру, поддерживаемую мезосальпинксом, продолжением широкой связки ^{брюшины1,4}. Кроме того, яйцевод мыши заключен в бурсальный мешок, что увеличивает вероятность переноса ооцитов в ^{яйцевод4}. Ампула определяется как место оплодотворения, из которого развивающиеся эмбрионы переходят в перешеек перед попаданием в ^матку5. Трубные сегменты имеют диаметр 200-400 мкм, а более длинные ампулярии и перешейки составляют примерно 0,5-1,0 см в ^длину4. Яйцевод растягивается во время эстрального цикла, а ампулы и инфундибулы более различимы, чем перешеек1.

Чрезмерная пролиферация клеток, особенно секреторных клеток, характеризует поражения предшественников серозных опухолей, обнаруженных в полости малого ^таза6. Эти предшественники серозных интраэпителиальных поражений возникают в эпителии яйцевода исключительно в области малоберцов; неизвестно, почему образование поражения ограничено этой областью, где обычно преобладающий тип клеток является реснитчатым, а не секреторным2,7,8. Региональность с точки зрения нормальной физиологической функции, а также повышенный интерес к яйцеводному происхождению рака яичников9,10,11,12,13 подчеркивают важность отдельной оценки сегментов яйцевода.

Метод, описанный здесь, детализирует сбор отдельных сегментов яйцевода для последующего анализа экспрессии специфических для сегмента генов и функции диссоциированных клеток. Традиционно многие ткани обрабатываются для экстракции всей РНК либо по фенолу: метод хлороформа, либо метод полной экстракции на колонке; однако мы обнаружили, что качество РНК поддерживалось при получении достаточного выхода с помощью описанного комбинированного метода. Используя этот метод, очень маленькие функциональные сегменты яйцевода могут быть обработаны для последующего анализа, а не для исследования яйцевода в целом, что может маскировать результаты, репрезентативные для различных ^{сегментов14}.

Диссоциированные мышиные клетки яйцеводов редко исследовались с помощью проточной цитометрии, скорее всего, из-за предельного выхода клеток из этой ткани. Один из подходов к преодолению этой проблемы заключался в диссоциации клеток, выращивании их в культуре, а затем стимуляции редифференцировки in vitro для получения соответствующих номеров клеток для последующего анализа клеток15,16,17,18. Ограничением этого подхода является время ex vivo и измененная микросреда в культуре, оба из которых, вероятно, изменяют экспрессию генов. Существует также предположение, что морфологическая редифференцировка имеет ту же транскрипционную и протеомную сигнатуру, что и у интактного животного. Современный метод диссоциации был разработан для достижения наибольшего количества эпителиальных клеток в гетерогенной популяции яйцеводных клеток при сохранении дифференцировки одиночных клеток. Кроме того, в основном неферментативный подход, вероятно, ограничивает потерю белков клеточной поверхности.

Protocol

Все процедуры обращения с животными и их процедуры были одобрены Калифорнийским университетом, институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Риверсайде и соответствовали руководящим принципам Американской ассоциации по уходу за лабораторными животными, Мин…

Representative Results

Описанный протокол диссоциации дает 100 000-120 000 клеток на мышь с объединением обоих яйцеводов. Метод достаточно мягкий, чтобы оставить многореснитчатые клеточные границы нетронутыми, что позволяет проводить различие между мультиреснитчатыми клетками и секреторными клетками и проверят…

Discussion

Три сегмента яйцевода гистологически, морфологически и функционально ^{различны1,2,3}. Эпителий сильно варьируется от одного конца яйцевода к другому. Реснитчатые клетки доминируют на фимбриальном/инфундибулярном конце, в то время как се?…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines