Mikrodissection och dissociation av Murine Oviduct: Individuell segmentidentifiering och isolering av encellsceller

Summary

En metod för mikrodissection av musovidukten som möjliggör insamling av de enskilda segmenten samtidigt som RNA-integriteten upprätthålls presenteras. Dessutom beskrivs icke-enzymatiska oviductal cell dissociation förfarande. Metoderna är lämpliga för efterföljande gen- och proteinanalys av de funktionellt olika oviduktala segmenten och dissocierade oviduktala celler.

Abstract

Musmodellsystem är oöverträffade för analys av sjukdomsprocesser på grund av deras genetiska manipulabilitet och den låga kostnaden för experimentella behandlingar. Men på grund av sin lilla kroppsstorlek har vissa strukturer, såsom äggledaren med en diameter på 200-400 μm, visat sig vara relativt svåra att studera förutom genom immunohistokemi. Nyligen har immunohistokemiska studier avslöjat mer komplexa skillnader i oviduktsegment än vad som tidigare erkänts; Således är äggledaren indelad i fyra funktionella segment med olika förhållanden av sju distinkta epitelcelltyper. De olika embryological ursprung och förhållanden av epitelial celltyper sannolikt gör de fyra funktionella regionerna differentiellt mottagliga för sjukdom. Till exempel uppstår prekursorskador till serösa intraepithelial carcinom från infundibulum i musmodeller och från motsvarande fimbrial regionen i den mänskliga äggledaren. Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för mikrodissection för att dela upp äggledaren på ett sådant sätt att den ger en tillräcklig mängd och renhet av RNA som är nödvändig för nedströmsanalys såsom omvänd transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) och RNA-sekvensering (RNAseq). Också beskrivs är en mestadels icke-enzymatiska vävnad dissociation metod lämplig för flöde cytometri eller en cell RNAseq analys av fullt differentierade oviductal celler. De beskrivna metoderna kommer att underlätta ytterligare forskning med hjälp av murinovidukten inom reproduktion, fertilitet, cancer och immunologi.

Introduction

Murinovidukten liknar funktion och morfologi till det mänskliga ^äggledaren1. Båda består av en pseudostratified ciliated epitelium, bestående av två historiskt beskrivna epitelial bosatta celler: ciliated celler och sekretoriska ^celler1,2. Ovidukten har tre klassiskt erkända segment: infundibulum, ampulla och näset. I en ny studie, Harwalkar et al. ³ undersökt oviduct morfologi och genuttryck som leder till expansion av kategorisering av bosatta epitelceller till sju distinkta populationer. Dessutom etablerade de ampullary-isthmus korsningen som ett distinkt segment av ^oviduct3. Metoden som beskrivs häri, som fokuserar på infundibulum, ampulla och näs, skulle lätt kunna utvidgas till att omfatta den ampullära istmiska korsningen ^också2,3. Den infundibulära regionen innehåller ostium, eller öppning av ovidukten, och inkluderar fimbrialregionen samt den proximala stjälken. Rör sig mot livmodern, nästa är ampulla, och sedan näset. Ciliated celler är mest framträdande i den distala änden av regionen, proximal till äggstocken eller infundibulum, medan sekretoriska celler är mest framträdande i proximal ände eller näs ^segmentet1. Till skillnad från det mänskliga äggledaren är murinovidukten en spiralformad struktur som stöds av mesosalpinx, en förlängning av det breda ligamentet ^{peritoneum1,4}. Dessutom är musovidukten innesluten i en bursalsäck som ökar sannolikheten för äggcellöverföring till ^äggledaren4. Ampulla identifieras som platsen för befruktning, från vilken utvecklande embryon passerar in i näset innan de går in i ^livmodern5. Tubalsegmenten är 200-400 μm i diameter och de längre ampullära och näsregionerna är cirka 0,5-1,0 cm ^långa4. Oviduct distends under den estrous cykeln och ampulla och infundibulum är mer distensible än ^isthmus1.

Över spridning av celler, särskilt sekretoriska celler, karakteriserar prekursor skador till serösa tumörer som finns i bäckenhålorna ^hålighet6. Dessa prekursor serous intraepithelial organskador uppstår i oviduct epitelium endast i fimbrial regionen. det är okänt varför lesion bildas är begränsad till denna region där normalt den dominerande celltypen är ciliated, inte secretory2,7,8. Regionaliteten när det gäller normal fysiologisk funktion, liksom ökat intresse för äggledscancerns oviduktala ursprung9,10,11,12,13, understryker vikten av separat utvärdering av äggledarens segment.

Metoden som beskrivs här beskriver insamlingen av separata oviductal segment för efterföljande nedströms analyser av segment-specifika gen uttryck och funktion av dissociated celler. Traditionellt bearbetas många vävnader för hela RNA-extraktion efter antingen fenol: kloroformmetod eller en komplett extraktionsmetod på kolonnen; Vi fann dock att RNA kvalitet bibehölls samtidigt som det gav tillräcklig avkastning med den beskrivna kombinationsmetoden. Med hjälp av denna metod kan mycket små funktionella segment av äggledaren bearbetas för nedströmsanalyser snarare än att undersöka äggledaren som helhet, vilket kan maskera resultat som är representativa för de olika ^segmenten14.

Dissociated murine oviductal celler har sällan undersökts av flöde cytometri, troligen på grund av att begränsa cellutbytet från denna vävnad. Ett tillvägagångssätt för att övervinna detta problem har varit att separera celler, odla dem i kultur och sedan stimulera återdifferentiering in vitro för att få lämpliga cellnummer för nedströms cellanalys15,16,17,18. En begränsning till detta tillvägagångssätt är tid ex vivo och förändrad mikromiljön i kultur, som båda sannolikt förändra genuttryck. Det finns också ett antagande att morfologiska re-differentiering har samma transkriptionella och proteomiska signatur som var närvarande i det intakta djuret. Den nuvarande dissociation metoden utformades för att uppnå det högsta antalet epitelial celler i en heterogen oviductal cell population samtidigt upprätthålla en enda cell differentiering. Vidare begränsar den mestadels icke-enzymatiska metoden sannolikt förlusten av cellytans proteiner.

Protocol

All djurhantering och djurprocedurer godkändes av University of California, Riverside institutional animal care and use committee och var i enlighet med riktlinjer från American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture och National Institutes of Health. Den beskrivna metoden används C57BL/6 vuxna, kvinnliga möss. Alla djur avlivades genom halshuggning före vävnadsskörd. OBS: En översikt över protokollet, som använder ett blått färgämne för a…

Representative Results

Det beskrivna dissociationsprotokollet ger 100 000-120 000 celler per mus med poolning av båda äggledaren. Metoden är skonsam nog att lämna multikilierade cellgränser intakta, vilket möjliggör en åtskillnad mellan multikilierade celler och sekretoriska celler, och verifierar att matsmältningsmetoden är skonsam nog att förhindra avdifferentiering. Representativa immunofluorescensbilder i figur 5 visar småcellsklumpar efter steg 4.2.1, fixerad i 3 min i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DP…

Discussion

De tre segmenten av äggledaren är histologiskt, morfologiskt och funktionellt distinkt1,2,3. Epitelet varierar kraftigt från ena änden av äggledaren till den andra. Ciliated celler dominerar vid fimbrial/infundibular änden, medan sekretoriska celler dominerar i den isthmic ^regionen1. Även om denna övergripande gradient har erkänts under en tid, har det senaste arbetet avslöjat fler skillnader me…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines