ゾヌラー繊維の粘弾性特性を決定するための生物学的調製と機械的技術
Summary
プロトコールは、細胞外マトリックス粘弾性およびタンパク質組成または環境因子への依存性の研究のための方法を記載する。標的とするマトリックスシステムは、マウスの帯状疱疹である。この方法の性能は、野生型ゾーン状繊維の粘弾性挙動をミクロフィブリル関連糖タンパク質-1を欠損したものと比較することによって実証される。
Abstract
弾力性は、血管、筋肉、肺などの組織の機能に不可欠です。この特性は、主に細胞外マトリックス(ECM)、細胞および組織を一緒に結合するタンパク質メッシュワークに由来する。ECMネットワークの弾性特性がその組成にどのように関連しているか、およびECMの緩和特性が生理学的役割を果たすかどうかは、まだ完全には対処されていない問題である。課題の一部は、ほとんどのECMシステムの複雑なアーキテクチャと、ECMコンポーネントの構造を損なうことなくECMコンポーネントを分離することの難しさにあります。1つの例外は、脊椎動物の目に見られるECMシステムである帯状疱疹です。帯状突起は、レンズと眼壁との間の無細胞空間にまたがる長さ数百〜数千マイクロメートルの繊維からなる。この報告では、帯状の高度に組織化された構造を利用して、その粘弾性特性を定量化し、個々のタンパク質成分の寄与を決定する機械的技術について説明する。この方法は、レンズと帯状動脈を露出させるために固定された眼の解剖を含み、張力が監視されている間に帯状線維を均等に引き伸ばすプルアップ技術を採用する。この技術は比較的安価でありながら、特定のゾーン状タンパク質を欠いているマウスまたは加齢に伴うマウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性の変化を検出するのに十分な感度を有する。ここで紹介する方法は、主に眼の発達と疾患を研究するために設計されていますが、弾性ECMの粘弾性特性とイオン濃度、温度、シグナル伝達分子との相互作用などの外的要因の役割に関するより広範な疑問を探求するための実験モデルとしても役立つ可能性があります。
Introduction
脊椎動物の目には、網膜に画像の焦点を合わせるのに役立つ生きた光学レンズが含まれています1。レンズは、図1Aに示すように、繊細で放射状に配向したファイバーのシステムによって光軸上に吊り下げられています。一方の端では、繊維は水晶体赤道に付着し、他方の端では毛様体の表面に付着する。それらの長さは、マウスの150μmからヒトの1mmまでの距離にまたがる。集合的に、これらの繊維は、Zinn2の帯状突、毛様体帯、または単に帯状突起として知られている。眼の外傷、疾患、および特定の遺伝性疾患は、ゾーン線維の完全性に影響を与え3、最終的な障害およびそれに伴う視力喪失をもたらす可能性がある。マウスでは、繊維は主にフィブリリン-2タンパク質からなるコアを有し、フィブリリン-14に富むマントルに囲まれている。帯状線維は目に特有のものですが、体内の他の場所に見られるエラスチンベースのECM線維と多くの類似点があります。後者はフィブリリン-1マントル5で覆われており、ゾーン状繊維6と同様の寸法を有する。潜在形質転換成長因子β結合タンパク質(LTBP)およびミクロフィブリル関連糖タンパク質-1(MAGP-1)などの他のタンパク質は、両方のタイプの繊維と関連して見出される7、8、9、10、11。ゾーン状繊維の弾性率は0.18〜1.50MPa12、13、14、15、16の範囲であり、エラスチン系繊維(0.3〜1.2MPa)17に匹敵する。これらの構造的および機械的類似性により、ゾーン関連タンパク質の役割に関する洞察は、他のECM弾性繊維におけるそれらの役割を解明するのに役立つ可能性があると私たちは信じています。
ここで説明する方法を開発する主な目的は、遺伝性眼疾患の進行における特定のゾーンタンパク質の役割についての洞察を得ることである。一般的なアプローチは、野生型マウスにおけるゾーン状線維の粘弾性特性を、ゾーン状タンパク質をコードする遺伝子に標的変異を有するマウスの粘弾性特性と比較することである。帯状繊維の弾力力学的特性を測定するためにいくつかの方法が以前に使用されてきたが、すべてはるかに大きな動物の目のために設計されていた12,13,14,15,16。そのようなモデルは遺伝的に扱いにくい。私たちは、マウスの小さくて繊細な目により適した実験方法の開発を目指しました。
マウス帯状線維の粘弾性を評価するために開発した方法は、プルアップアッセイ4,18と呼ばれる技術であり、図1に視覚的に要約されています。プルアップ方法と結果の分析の詳細な説明を以下に示します。まず、プロジェクトで使用された3次元(3D)印刷部品を含む装置の構成について説明します。次に、実験用の眼の取得と準備に使用されるプロトコルを詳述します。最後に、ゾーン状繊維の粘弾性特性を決定するためのデータを取得する方法について、段階的な指示を提供します。代表的な結果のセクションでは、MAGP-119を欠損したマウスからのゾーン状線維の粘弾性特性に関する我々の方法で得られた以前に未発表のデータと、年齢が一致した野生型動物から得られた対照セットを共有する。最後に、この方法の利点と限界に関する一般的な発言と、環境的および生化学的要因がECM繊維の粘弾性特性にどのように影響するかを解明する可能性のある実験の提案で締めくくります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゾーンは、ファイバーが対称に配置され、光軸に沿って眼レンズを変位させることによって同じように操作できる珍しいECMシステムです。この空間はまた、細胞を破壊せずに容易にアクセスすることができ、繊維を元の状態に近い環境で研究することを可能にする。プルアップ技術は、このECMプレゼンテーションを利用して、遺伝的に扱いやすいシステムであるマウスからの繊細な繊維を操?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH R01 EY029130 (S.B.) および P30 EY002687 (S.B)、R01 HL53325 および Ines Mandl Research Foundation (R.P..M)、Marfan Foundation、および Washington University の眼科および視覚科学科 (Research to Prevent Blindness) からの無制限の助成金によって支援されました。J.R.はまた、このプロジェクトを支援するために保健薬科大学から助成金を受けました。
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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