Biologisk beredning och mekanisk teknik för att bestämma viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer
Summary
Protokollet beskriver en metod för studier av extracellulär matris viskoelasticitet och dess beroende av protein sammansättning eller miljöfaktorer. Matrissystemet som är riktat är muszonuleet. Metodens prestanda demonstreras genom att jämföra viskoelastiskt beteende hos vilda zonulära fibrer med de som saknar mikrofibril-associerade glykoprotein-1.
Abstract
Elasticitet är viktigt för funktionen av vävnader som blodkärl, muskler och lungor. Den här egenskapen härleds främst från den extracellulära matrisen (ECM), proteinmaskverket som binder samman celler och vävnader. Hur de elastiska egenskaperna hos ett ECM-nät relaterar till dess sammansättning, och huruvida ECM:s avslappningsegenskaper spelar en fysiologisk roll, är frågor som ännu inte har behandlats fullt ut. En del av utmaningen ligger i den komplexa arkitekturen i de flesta ECM-system och svårigheten att isolera ECM-komponenter utan att kompromissa med deras struktur. Ett undantag är zonule, ett ECM-system som finns i ryggradsdjurens öga. Zonule består av fibrer hundratals till tusentals mikrometer i längd som sträcker sig över det cellfria utrymmet mellan linsen och ögonväggen. I denna rapport beskriver vi en mekanisk teknik som drar nytta av den välorganiserade strukturen i zonule för att kvantifiera dess viskoelastiska egenskaper och för att bestämma bidraget från enskilda proteinkomponenter. Metoden innebär dissekering av ett fast öga för att exponera linsen och zonule och använder en pull-up-teknik som sträcker zonfibrerna lika medan deras spänning övervakas. Tekniken är relativt billig men känslig nog att upptäcka förändringar i viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer hos möss som saknar specifika zonulära proteiner eller med åldrande. Även om metoden som presenteras här är främst utformad för att studera okulär utveckling och sjukdom, kan den också fungera som en experimentell modell för att utforska bredare frågor om de viskoelastiska egenskaperna hos elastiska ECM och rollen av yttre faktorer som jonisk koncentration, temperatur och interaktioner med signalmolekyler.
Introduction
Ett ryggradsdjurs öga innehåller en levande optisk lins som hjälper till att fokusera bilder på näthinnan1. Linsen är upphängd på den optiska axeln av ett system av känsliga, radiellt orienterade fibrer, vilket illustreras i figur 1A. I ena änden fäster fibrerna på linsvatorn och i den andra på ytan av ciliarykroppen. Deras längder sträcker sig från 150 μm hos möss till 1 mm hos människor. Tillsammans är dessa fibrer kända som Zonule av Zinn2, ciliary zonule, eller helt enkelt zonule. Okulär trauma, sjukdom och vissa genetiska störningar kan påverka integriteten hos zonulära fibrer3, vilket resulterar i deras eventuella misslyckande och åtföljande förlust av syn. Hos möss har fibrerna en kärna som till största delen består av proteinet fibrillin-2, omgiven av en mantel rik på fibrillin-14. Även om zonulära fibrer är unika för ögat, bär de många likheter med elastinbaserade ECM-fibrer som finns någon annanstans i kroppen. De senare är täckta av en fibrillin-1 mantel5 och har liknande dimensioner som zonulära fibrer6. Andra proteiner, såsom latent-transformerande tillväxtfaktor β-bindande proteiner (LTBC) och mikrofibril-associerade glykoprotein-1 (MAGP-1), finns i samband med båda typerna av fibrer7,8,9,10,11. Den elastiska modulen av zonulära fibrer ligger i intervallet 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, jämförbar med den för elastinbaserade fibrer (0,3-1,2 MPa)17. Dessa arkitektoniska och mekaniska likheter leder oss att tro att någon insikt i rollerna för zonule-associerade proteiner kan hjälpa till att klargöra deras roller i andra ECM elastiska fibrer.
Huvudsyftet med att utveckla den metod som beskrivs här är att få insikter om specifika zonulära proteiners roll i utvecklingen av ärftlig ögonsjukdom. Det allmänna tillvägagångssättet är att jämföra de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer i vilda möss med möss som bär riktade mutationer i gener som kodar zonulära proteiner. Medan flera metoder tidigare har använts för att mäta de elastomekaniska egenskaperna hos zonulära fibrer, var alla utformade för ögonen på mycket större djur12,13,14,15,16. Som sådana modeller är inte genetiskt dragbara; vi försökte utveckla en experimentell metod som var bättre lämpad för mössens små och känsliga ögon.
Metoden vi utvecklade för att bedöma viskoelasticiteten hos muszonulära fibrer är en teknik som vi hänvisar till som pull-up assay4,18, som sammanfattas visuellt i figur 1. Nedan följer en detaljerad beskrivning av pull-up-metoden och analysen av resultaten. Vi börjar med att beskriva konstruktionen av apparaten, inklusive de tredimensionella (3D)-utskrivna delarna som används i projektet. Därefter beskriver vi protokollet som används för att få och förbereda ögonen för experimentet. Slutligen ger vi steg-för-steg-instruktioner om hur man får data för bestämning av de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer. I avsnittet Representativa resultat delar vi tidigare opublicerade data som erhållits med vår metod om de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer från möss som saknar MAGP-119 samt en kontrolluppsättning som erhållits från åldersmatchade vilda djur. Slutligen avslutar vi med allmänna anmärkningar om metodens fördelar och begränsningar och förslag på potentiella experiment som kan belysa hur miljömässiga och biokemiska faktorer påverkar ECM-fibrernas viskoelastiska egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zonule är ett ovanligt ECM-system där fibrer är ordnade symmetriskt och kan manipuleras identiskt genom att förskjuta ögonlinsen längs den optiska axeln. Utrymmet kan också lätt nås utan cellulära störningar, vilket gör att fibrerna kan studeras i en miljö nära deras ursprungliga tillstånd. Pull-up tekniken drar nytta av denna ECM presentation för att manipulera de känsliga fibrerna från möss, ett genetiskt dragbart system, och exakt kvantifiera deras mekaniska egenskaper. Detta har gjort det möjligt …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R01 EY029130 (S.B.) och P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 och Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation och ett obegränsat anslag till institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid Washington University från Forskning till förhindra blindhet. J.R. fick också ett stipendium från University of Health Sciences and Pharmacy till stöd för detta projekt.
Materials
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S. Zinn’s zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
- Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
