تباين بين ثلاث تقنيات تلقيح تستخدم لتحديد جنس الفيوزاريوم أوكسيسبوروم f.sp غير المعروف. نيفيوم يعزل
Summary
تتطلب إدارة ذبول الفيوزاريوم للبطيخ معرفة الأجناس المسببة للأمراض الموجودة. هنا ، نصف تراجع الجذر ، وبذر النواة الموبوءة ، وطرق التلقيح المعدلة بالدرج لإثبات فعاليتها في كتابة العرق للفطريات المسببة للأمراض Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Abstract
عاد ذبول البطيخ الفيوزاريوم (Citrullus lanatus) ، الناجم عن Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon) ، إلى الظهور كقيد إنتاج رئيسي في جنوب شرق الولايات المتحدة الأمريكية ، وخاصة في فلوريدا. ويتطلب نشر استراتيجيات الإدارة المتكاملة للآفات، مثل الأصناف المقاومة الخاصة بالعرق، معلومات عن تنوع العامل الممرض وكثافته السكانية في حقول المزارعين. على الرغم من إحراز بعض التقدم في تطوير أدوات التشخيص الجزيئي لتحديد عزلات مسببات الأمراض، فإن تحديد العرق غالبا ما يتطلب نهج الفحص البيولوجي.
تم إجراء كتابة السباق عن طريق التلقيح الجذري ، وطريقة بذر النواة الموبوءة ، وطريقة غمس الدرج المعدلة مع كل من فروق البطيخ الأربعة (Black Diamond ، Charleston Grey ، Calhoun Grey ، Plant Introduction 296341-FR). يتم تعيين العزلات تسمية سباق عن طريق حساب حدوث المرض بعد خمسة أسابيع من التلقيح. إذا كان أقل من 33٪ من النباتات لصنف معين من الأعراض ، فقد تم تصنيفها على أنها مقاومة. واعتبرت تلك الأصناف التي يزيد معدل حدوثها عن 33٪ عرضة للإصابة. تصف هذه الورقة ثلاث طرق مختلفة للتلقيح للتأكد من العرق ، وتراجع الجذر ، والنواة الموبوءة ، والتلقيح المعدل بالدرج ، والتي تختلف تطبيقاتها وفقا للتصميم التجريبي.
Introduction
الفطريات المنقولة بالتربة التي تشكل مركب أنواع Fusarium oxysporum (FOSC) هي مسببات أمراض نباتية نصف حيوية مؤثرة يمكن أن تسبب مرضا خطيرا وفقدان الغلة في مجموعة متنوعة من المحاصيل1. ذبول الفيوزاريوم من البطيخ ، الناجم عن F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) ، يزداد في النطاق والإصابة والشدة في جميع أنحاء العالم في العقود القليلة الماضية 2,3. في الشتلات ، غالبا ما تشبه أعراض ذبول الفيوزاريوم التخميد. في النباتات القديمة ، تصبح أوراق الشجر رمادية وكلوروتيكية ونخرية. في نهاية المطاف ، يتطور ذبول النباتات إلى انهيار النبات بالكامل والموت4. يحدث فقدان الغلة المباشر بسبب الأعراض وموت النبات ، في حين يمكن أن يحدث فقدان الغلة غير المباشر بسبب أضرار أشعة الشمس الناجمة عن القضاء على المظلة الورقية5. لم يلاحظ أبدا التكاثر الجنسي والهياكل التناسلية المرتبطة به في F. oxysporum. ومع ذلك ، ينتج العامل الممرض نوعين من الجراثيم اللاجنسية ، micro- و macroconidia ، بالإضافة إلى هياكل البقاء على قيد الحياة الأكبر والطويلة الأجل تسمى chlamydospores ، والتي يمكن أن تعيش في التربة لسنوات عديدة6.
يتم تصنيف FOSC إلى أشكال خاصة بناء على نطاقات المضيف المرصودة ، وعادة ما تقتصر على واحد أو عدد قليل من الأنواع المضيفة1. على الرغم من أن الأبحاث الحديثة قد أشارت إلى أن هذا النوع المركب قد يكون مركبا من 15 نوعا مختلفا ، إلا أن الأنواع المعينة التي تصيب البطيخ غير معروفة حاليا7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) هو اسم لمجموعات السلالات التي تصيب حصريا Citrullus lanatus أو البطيخ المستأنس 8,9. F. تظهر سلالات أوكسيسبوروم داخل معظم الأنواع المسببة للأمراض مستويات معينة من التنوع فيما يتعلق بمكوناتها الوراثية وضراوتها تجاه الأنواع المضيفة. على سبيل المثال ، قد تصيب سلالة واحدة جميع أصناف المضيف ، في حين أن سلالة أخرى قد تصيب فقط الأصناف الأكثر عرضة للإصابة. لتفسير هذا الاختلاف ، يتم تصنيف هذه المجموعات بشكل غير رسمي إلى أجناس بناء على العلاقات التطورية أو الخصائص الظاهرية المشتركة. داخل فون ، تم تمييز أربعة أجناس (0 و 1 و 2 و 3) بناء على إمراضها ضد مجموعة من أصناف البطيخ المختارة ، مع اكتشاف السباق 3 الذي حدث مؤخرا10.
على الرغم من هذا التنوع الواضح ، لا يمكن التمييز بين مورفولوجيا الجراثيم أو hyphae بين أجناس أعراق Fon ، مما يعني أن هناك حاجة إلى فحوصات جزيئية أو مظهرية لتحديد العرق الفريدللمعزول 11. حددت الأبحاث الجزيئية بعض الاختلافات الجينية. على سبيل المثال ، تمت دراسة دور المستجيبات Secreted in Xylem (SIX) لسنوات في F. oxysporum ، وتم تحديد موقع بعض هذه المستجيبات على الكروموسومات المتبادلة أثناء نقل الجينات الأفقي12. على سبيل المثال ، تم العثور على SIX6 في سباقات Fon 0 و 1 ولكن ليس في السباق 213. وقد تورطت ستة مؤثرات في إمراض F. oxysporum f. sp. lycopersici و F. oxysporum f. sp. cubense ، والتي تسبب ذبول Fusarium على الطماطم والموز ، على التوالي14،15،16،17. وقد مكن تحليل ملامح المستجيبات SIX بين سلالات F. oxysporum f. sp. spiniciae ، ممرض ذبول الفيوزاريوم على السبانخ ، من التصنيف الذي يعكس بدقة التنوع الجيني والمظهري18. ومع ذلك ، فإن الاختلافات بين آليات الضراوة في سباقات فون ليست مفهومة تماما حاليا ، وقد أظهرت الفحوصات الجزيئية التي تم تطويرها عند استخدامها نتائج غير متسقة وغير دقيقة19. لذلك ، فإن نتائج النمط الظاهري من فحوصات العدوى هي حاليا أفضل طريقة لتصنيف العزلات.
F. أوكسيسبوروم يصيب المضيفين في البداية من خلال الجذور قبل أن يشق طريقه إلى xylem20. وهذا يجعل التلقيح المباشر لجذور صنف مضيف معين طريقة فعالة لأداء كتابة العرق وهو أساس طرق التلقيح الجذري وتراجع الدرج21. عندما لا تصيب مضيف ، يقيم F. oxysporum في التربة ويمكن أن يظل نائما لسنوات. زراعة أصناف البطيخ الحساسة في التربة من حقل الاهتمام هي إحدى الطرق لاختبار وجود فون. إن توسيع هذه الطريقة لتشمل أصنافا ذات مستويات مختلفة معروفة من المقاومة في التربة الموبوءة عمدا ب Fon هو أيضا طريقة جيدة لأداء كتابة العرق (الجدول 1) وهو أساس طريقة بذر النواة الموبوءة. طريقة غمس الدرج المعدلة هي اختلاف عن طريقة غمس الدرج الأصلية التي تسمح بكتابة سباق عالية الإنتاجية حيث يمكن التحقيق في العديد من النباتات والعزلات الميدانية بسرعة22. وتشمل العوامل الهامة للفحص الحيوي السريع والناجح لكتابة العرق استخدام الأصناف التي لديها اختلافات موثقة في مقاومة الأجناس المسببة للأمراض المختلفة، وضمان أن يكون اللقاح نشطا بيولوجيا ووفيرا أثناء العدوى، والحفاظ على بيئة مواتية للممرض والمضيف على حد سواء، واستخدام نظام تصنيف متسق لشدة المرض أو حدوثه. تصف هذه الورقة طرق تراجع الجذر23,24 ، وبذر النواة الموبوءة 25,26 ، وطرق الغمس 22 المعدلة لكتابة السباق المظهره بناء على المبادئ الموضحة أعلاه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تقديم ثلاث طرق لكتابة العرق. كل من هذه الطرق هي الأنسب لأسئلة معينة وظروف تجريبية. ربما تكون طريقة تلقيح النواة الموبوءة (الإصابة بالتربة) أبسط وأكثر وضوحا ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص لتقييم الإمراض30. يعد استخدام هذه الطريقة لكتابة السباق البسيطة فعالا للغاية. ومع ذلك ، فإن …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشيد بالدكتور علي ومختبر التشخيص الجزيئي النباتي وكذلك الدكتور بينغشنغ جي في جامعة جورجيا ، الذي ساعدت قيادته ودعمه في إنشاء برنامج Fon الخاص بنا.
Materials
| 100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
| 1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
| 50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
| Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
| Bleach | Walmart | 587192290 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
| CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
| cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
| Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
| Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
| Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
| Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
| Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
| granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
| Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
| Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
| Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
| Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
| Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
| Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
| P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
| Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
| Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
| Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
| Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
| Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
| Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
| Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
| Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
| Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
| Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
| Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
| Timer | Walmart | TM-01 | |
| V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
| vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
| Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
| Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
| Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
| Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
| Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |
References
- Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
- Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
- Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
- Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
- Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
- Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
- Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
- Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
- Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
- Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
- Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
- Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
- Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
- Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
- Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
- Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
- Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
- Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
- Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
- Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
- Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
- Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
- Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
- Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
- Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
- Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
- Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
- Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
- Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
- Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
- Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
- Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
- Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
- Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
- Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
- Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
- Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
- Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
- Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
- Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
- van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
- Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
- O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
- Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
- Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).
