Un contraste de trois techniques d’inoculation utilisées pour déterminer la race de Fusarium oxysporum f.sp. inconnu niveum Isolats

Summary

La gestion de la flétrissure fusarium de la pastèque nécessite la connaissance des races pathogènes présentes. Ici, nous décrivons les méthodes d’inoculation par trempage des racines, d’ensemencement infesté des grains et de barquette modifiée pour démontrer leur efficacité dans le typage racinaire du champignon pathogène Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

La flétrissure de fusarium de la pastèque (Citrullus lanatus), causée par Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), est réapparue comme une contrainte de production majeure dans le sud-est des États-Unis, en particulier en Floride. Le déploiement de stratégies intégrées de lutte antiparasitaire, comme les cultivars résistants spécifiques à la race, nécessite des informations sur la diversité et la densité de population de l’agent pathogène dans les champs des producteurs. Malgré certains progrès dans le développement d’outils de diagnostic moléculaire pour identifier les isolats d’agents pathogènes, la détermination de la race nécessite souvent des approches de bioessai.

Le typage de race a été effectué par inoculation par trempage racinaire, méthode d’ensemencement du noyau infesté et méthode modifiée de barquette avec chacun des quatre différentiels de pastèque (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Les isolats se voient attribuer une désignation de race par calcul de l’incidence de la maladie cinq semaines après l’inoculation. Si moins de 33 % des plantes d’un cultivar particulier étaient symptomatiques, elles étaient classées comme résistantes. Les cultivars dont l’incidence était supérieure à 33 % étaient considérés comme sensibles. Cet article décrit trois méthodes différentes d’inoculation pour déterminer la race, le trempage racinaire, le noyau infesté et l’inoculation modifiée par bac, dont les applications varient selon la conception expérimentale.

Introduction

Les champignons du sol qui composent le complexe d’espèces Fusarium oxysporum (FOSC) sont des agents pathogènes hémibiotrophes des plantes qui peuvent causer de graves maladies et une perte de rendement dans une gamme variée de cultures¹. La flétrissure fusarium de la pastèque, causée par F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), a augmenté en portée, en incidence et en gravité dans le monde entier au cours des dernières décennies ^2,3. Chez les semis, les symptômes du flétrissement de Fusarium ressemblent souvent à un amortissement. Chez les plantes plus âgées, le feuillage devient gris, chlorotique et nécrotique. Finalement, le flétrissement des plantes progresse vers l’effondrement complet de la plante et la mort⁴. La perte de rendement directe se produit en raison des symptômes et de la mort de la plante, tandis que la perte de rendement indirecte peut survenir en raison des dommages causés par le soleil par l’élimination de la canopée foliaire⁵. La reproduction sexuée et les structures reproductrices associées n’ont jamais été observées chez F. oxysporum. Cependant, l’agent pathogène produit deux types de spores asexuées, les micro- et macroconidies, ainsi que des structures de survie plus grandes et à long terme appelées chlamydospores, qui peuvent survivre dans le sol pendant de nombreuses années⁶.

Le FOSC est classé en formae speciales en fonction des gammes d’hôtes observées, généralement limitées à une ou quelques espèces hôtes¹. Bien que des recherches récentes aient indiqué que ce complexe d’espèces peut être un composite de 15 espèces différentes, les espèces particulières qui infectent la pastèque sont actuellement inconnues⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) est le nom des groupes de souches qui infectent exclusivement Citrullus lanatus ou la pastèque domestiquée ^8,9. Les souches de F. oxysporum dans la plupart des spécialités pathogènes présentent certains niveaux de diversité en ce qui concerne leurs composants génétiques et leur virulence envers une espèce hôte. Par exemple, une souche peut infecter tous les cultivars d’un hôte, tandis qu’une autre peut n’infecter que les cultivars les plus sensibles. Pour tenir compte de cette variation, ces groupes sont classés de manière informelle en races en fonction de relations évolutives ou de caractéristiques phénotypiques communes. Au sein de Fon, quatre races (0, 1, 2 et 3) ont été caractérisées en fonction de leur pathogénicité par rapport à un ensemble de cultivars de pastèques sélectionnés, la découverte de la race 3 ayant eu lieu récemment¹⁰.

Malgré cette diversité apparente, les morphologies des spores ou des hyphes ne sont pas distinguables entre les races de Fon, ce qui signifie que des tests moléculaires ou phénotypiques sont nécessaires pour identifier la race unique¹¹ d’un isolat. La recherche moléculaire a identifié certaines différences génétiques. Par exemple, le rôle des effecteurs sécrétés dans le xylème (SIX) a été étudié pendant des années chez F. oxysporum, et certains de ces effecteurs ont été localisés sur les chromosomes échangés lors du transfert horizontal de gènes¹². Par exemple, SIX6 se trouve dans les courses Fon 0 et 1 mais pas dans la course 2¹³. SIX effecteurs ont été impliqués dans la pathogénicité de F. oxysporum f. sp. lycopersici et F. oxysporum f. sp. cubense, qui provoquent la flétrissure de Fusarium sur la tomate et la banane, respectivement 14,15,16,17. L’analyse des profils effecteurs SIX parmi les souches de F. oxysporum f. sp. spiniciae, l’agent pathogène du flétrissement fusarium sur les épinards, a permis une classification qui reflète avec précision la diversité génétique et phénotypique¹⁸. Cependant, les différences entre les mécanismes de virulence des races de Fon ne sont actuellement pas entièrement comprises, et les tests moléculaires développés lors de leur utilisation ont montré des résultats incohérents et inexacts¹⁹. Par conséquent, les résultats phénotypiques des tests d’infection sont actuellement le meilleur moyen de classer les isolats.

F. oxysporum infecte d’abord les hôtes par les racines avant de remonter le xylème²⁰. Cela fait de l’inoculation directe des racines d’un cultivar hôte donné un moyen efficace d’effectuer le typage de race et constitue la base des méthodes d’inoculation root-dip et tray-dip²¹. Lorsqu’il n’infecte pas un hôte, F. oxysporum réside dans le sol et peut rester dormant pendant des années. Cultiver des cultivars de pastèque sensibles dans le sol à partir d’un domaine d’intérêt est une façon de tester la présence de Fon. L’extension de cette méthode pour inclure des cultivars de différents niveaux connus de résistance dans un sol délibérément infesté de Fon est également un bon moyen d’effectuer un typage de race (tableau 1) et constitue la base de la méthode d’ensemencement des grains infestés. La méthode modifiée de trempage par plateau est une variante de la méthode originale de trempage par plateau qui permet un typage de course à haut débit où de nombreuses plantes et isolats de champ peuvent être étudiés rapidement²². Les facteurs importants d’un essai biologique rapide et réussi comprennent l’utilisation de cultivars qui ont documenté des différences de résistance aux différentes races d’agents pathogènes, la garantie que l’inoculum est à la fois biologiquement actif et abondant pendant l’infection, le maintien d’un environnement propice à la fois à l’agent pathogène et à l’hôte, et l’utilisation d’un système d’évaluation cohérent de la gravité ou de l’incidence de la maladie. Cet article décrit les méthodes root-dip^23,24, infested kernel seeding^25,26 et tray-dip²² modifiées pour le typage phénotypique de la race sur la base des principes décrits ci-dessus.

Protocol

1. Détermination de la race par la méthode root-dip (RDM) Préparation de l’environnement expérimental Parce que l’expression des symptômes dépend fortement des conditions environnementales, maintenez les plantes dans une zone contrôlée. Surveillez l’humidité relative, la température, la photopériode et l’intensité lumineuse (Figure 1). Réglez la température à 26-28 °C, l’humidité relative à 50-75% et réglez une photopér…

Representative Results

Ces expériences aident à définir la résistance relative des cultivars couramment cultivés (tableau 1). Ces informations peuvent ensuite être utilisées pour guider les recommandations de gestion en fonction des populations locales de Fon. En d’autres termes, si la race 0 ou 1 est connue pour être présente dans un champ commercial, l’agriculteur peut être enclin à cultiver une variété « résistante » telle que Calhoun Gray, Sunsugar ou équivalent. Les résultats des essais biologiques…

Discussion

Trois méthodes de typage de race ont été présentées. Chacune de ces méthodes est la mieux adaptée à des questions et des conditions expérimentales particulières. La méthode d’inoculation du noyau infesté (infestation du sol) est peut-être plus simple et plus directe, ce qui la rend particulièrement utile pour l’évaluation de la pathogénicité³⁰. L’utilisation de cette méthode pour un typage de course simple est très efficace. Cependant, l’application de la méthode pour d…

Materials

100% Fuller’s Earth	Sigma-Aldrich	F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask	PYREX	4980-1L
15 mL falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
50 mL graduated cylinder	Lab Safety Supply	41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes	Fisher Scientific	05-413-921
Aluminum foil wrap	Reynolds Wrap	720
Bleach	Walmart	587192290
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-391-301
CaCO3	sigma-Aldrich	239216
cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-11
Cheesecloth	Lions Services, Inc	8305-01-125-0725
Clear plastic dishes	Visions Wave	999RP6CLSS	~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	Sterile
Ethanol	Fisher Chemical	A4094	100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights	MaxLume	Model T5	2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar	VWR International	90000-786
Hand-held Spray Bottle	Ability One	24122002	~0.95 L
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-55A	Two chamber hemacytometer
Lab trays	Fisher Scientific	15-236-2A
Large, sealable plastic bags	Ziploc	430805	38 cm x 38 cm
Mister / watering can	Bar5F	B10H22
Mushroom Bag Clamp	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D
Organic Rye Berries	Shroom Supply		0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips	Fisher Scientific	14-388-100
Petri dishes	Fisherbrand	FB0875713	Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
Plastic Pitcher	BrandTech	UX0600850	1 L or larger
Plastic planting pots	Neo/SCI	01-1177	~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin	Thermo Scientific	UX0601022	3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media	Cole-Parmer	UX1420028	Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g	Ohaus	30208458	Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore	Cole-Parmer	NC9585352
Small Mushroom grow bag	Shroom Supply		0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel	Walmart	563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells)	Speedling	Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells)	Speedling	Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL)	fisher Scientific	14-829-19C
Timer	Walmart	TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice	Walmart	564638212
vortex	Fisher Scientific	02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond	Willhite Seed Inc	17
Watermelon Seed – Calhoun Gray	Holmes Seed Company	4440
Watermelon Seed – Charleston Gray	Bonnie Plants	7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR	Contact authors	Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional)	Alachua County Feed & Seed