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Biologie

알려지지 않은 Fusarium oxysporum f.sp.의 인종을 결정하는 데 사용되는 세 가지 접종 기술의 대조. 니벳 격리

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

수박의 Fusarium wilt를 관리하려면 존재하는 병원균 종족에 대한 지식이 필요합니다. 여기에서, 우리는 병원성 균류 Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon)의 인종 타이핑에서 그들의 효능을 입증하기 위해 뿌리 딥, 감염된 커널 시딩, 및 변형된 트레이-딥 접종 방법을 설명한다.

Abstract

Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon)에 의해 유발 된 수박의 Fusarium wilt (Citrullus lanatus)는 미국 남동부, 특히 플로리다에서 주요 생산 제약으로 다시 부상했습니다. 인종별 내성 품종과 같은 통합 해충 관리 전략을 수립하려면 재배자의 분야에서 병원균의 다양성과 인구 밀도에 대한 정보가 필요합니다. 병원체 분리물을 확인하기 위한 분자 진단 도구 개발의 일부 진전에도 불구하고, 인종 결정은 종종 생물분석 접근법을 필요로 한다.

레이스 타이핑은 뿌리딥 접종, 감염된 커널 시딩 방법, 및 네 개의 수박 차동 각각을 사용한 변형된 트레이-딥 방법(블랙 다이아몬드, 찰스턴 그레이, 칼훈 그레이, 식물 소개 296341-FR)에 의해 수행되었다. 격리는 접종 후 다섯 주 후에 질병 발생률의 계산에 의해 인종 지정을 할당됩니다. 특정 재배자에 대한 식물의 33 % 미만이 증상이 있으면 내성으로 분류되었습니다. 발병률이 33 % 이상인 품종은 감수성이있는 것으로 간주되었습니다. 이 논문은 인종, 뿌리 딥, 감염된 커널 및 변형 된 트레이 딥 접종을 확인하기위한 세 가지 접종 방법을 설명하며, 실험 설계에 따라 응용 프로그램이 다릅니다.

Introduction

Fusarium oxysporum 종 복합체 (FOSC)를 구성하는 토양 매개 곰팡이는 다양한 범위의 작물에서 심각한 질병과 수확량 손실을 일으킬 수있는 영향력있는 반생물 영양 식물 병원균입니다1. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon)에 의해 야기 된 수박의 Fusarium wilt는 지난 수십 년 동안 전 세계적으로 범위, 발생률 및 심각도가 증가하고 있습니다 2,3. 묘목에서 Fusarium wilt의 증상은 종종 댐핑 오프와 유사합니다. 오래된 식물에서는 단풍이 회색, 엽록색 및 괴사가됩니다. 결국, 식물의 시들음은 완전한 식물 붕괴와 죽음으로 진행된다4. 직접적인 수확량 손실은 증상 및 식물 사멸로 인해 발생하는 반면, 간접 수확량 손실은 엽면 캐노피의 제거로 인한 태양 손상으로 인해 발생할 수 있습니다5. 성적 재생산 및 관련 생식 구조는 F. oxysporum 에서 관찰 된 적이 없습니다. 그러나 병원균은 두 가지 유형의 무성 포자, 마이크로 및 마크로 코니디아뿐만 아니라 수년 동안 토양에서 생존 할 수있는 클라미도스 포자 (chlamydospores)라고 불리는 더 크고 장기적인 생존 구조를 생산합니다6.

FOSC는 관찰 된 숙주 범위에 따라 포르마 스페셜로 분류되며, 일반적으로 하나 또는 몇 개의 숙주 종1로 제한됩니다. 최근의 연구에 따르면이 종 복합체는 15 종의 복합체 일 수 있지만 수박을 감염시키는 특정 종은 현재 알려지지 않았습니다7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon)은 시트룰루스 라나투스 또는 길들여진 수박 8,9를 독점적으로 감염시키는 균주 그룹의 이름입니다. F. 대부분의 병원성 포르마 특산물 내의 옥시스포럼 균주는 그들의 유전 성분 및 숙주 종에 대한 독성과 관련하여 특정 수준의 다양성을 나타낸다. 예를 들어, 한 균주는 숙주의 모든 품종을 감염시킬 수 있지만 다른 균주는 더 취약한 품종 만 감염시킬 수 있습니다. 그러한 변이를 설명하기 위해, 이들 집단들은 진화적 관계들 또는 공통된 표현형 특성들에 기초하여 비공식적으로 종족들로 분류된다. 폰 내에서 네 종족 (0, 1, 2 및 3)은 선택된 수박 품종 세트에 대한 병원성을 기반으로 특성화되었으며, 최근10 번 종족 3이 발견되었습니다.

이러한 명백한 다양성에도 불구하고, 포자 또는 균사의 형태학은 폰 종족의 종족들 사이에서 구별될 수 없으며, 이는 분리물의 독특한 인종(11)을 확인하기 위해 분자 또는 표현형 분석이 필요하다는 것을 의미한다. 분자 연구는 몇 가지 유전 적 차이를 확인했습니다. 예를 들어, 자일렘에서 분비된 (SIX) 이펙터의 역할은 F. 옥시스포럼에서 수년간 연구되어 왔으며, 이들 이펙터 중 일부는 수평 유전자 전달12 동안 교환된 염색체 상에 위치되어 있다. 예를 들어, SIX6은 Fon 레이스 0과 1에서는 발견되지만 레이스 213에서는 발견되지 않습니다. SIX 이펙터는 F. oxysporum f. sp. lycopersici 및 F. oxysporum f. sp. cubense의 병원성에 연루되어 토마토와 바나나에 Fusarium wilt를 각각14,15,16,17로 일으킨다. 시금치의 Fusarium wilt 병원균 인 F. oxysporum f. sp. spiniciae의 균주 중 SIX 이펙터 프로파일을 분석함으로써 유전 적 및 표현형 다양성을 정확하게 반영하는 분류가 가능해졌습니다18. 그러나, 폰 종족의 독성 기작 사이의 차이는 현재 완전히 이해되지 않았으며, 그들의 사용에 따라 개발 된 분자 분석은 일관되지 않고 부정확 한 결과를 보여주었습니다19. 따라서, 감염 분석으로부터의 표현형 결과는 현재 단리물을 분류하는 가장 좋은 방법이다.

F. oxysporarum은 처음에는 자일렘20을 올라가기 전에 뿌리를 통해 숙주를 감염시킵니다. 이것은 주어진 숙주 재배자의 뿌리를 직접 접종하여 인종 타이핑을 수행하는 효과적인 방법이되며 뿌리 딥 및 트레이 딥 접종 방법(21)의 기초가됩니다. 숙주를 감염시키지 않을 때, F. oxysporum은 토양에 거주하며 수년간 휴면 상태를 유지할 수 있습니다. 관심있는 분야에서 토양에서 감수성이있는 수박 품종을 재배하는 것은 Fon의 존재를 테스트하는 한 가지 방법입니다. 이 방법을 의도적으로 Fon에 감염된 토양에 다른 알려진 수준의 내성을 가진 품종을 포함하도록 확장하는 것도 인종 타이핑을 수행하는 좋은 방법이며 (표 1) 감염된 커널 파종 방법의 기초입니다. 변형된 트레이-딥 방법은 원래의 트레이-딥 방법의 변형으로, 많은 식물 및 현장 분리물을 신속하게 조사할 수 있는 고처리량 레이스 타이핑을 허용한다(22). 신속하고 성공적인 인종 타이핑 생물 분석의 중요한 요인으로는 다양한 병원체 종족에 대한 내성의 차이를 문서화 한 품종 사용, 접종물이 감염 중에 생물학적으로 활성이고 풍부하다는 것을 보장, 병원체와 숙주에 도움이되는 환경 유지, 질병의 중증도 또는 발병률에 대한 일관된 평가 시스템 사용 등이 있습니다. 이 논문에서는 위에서 설명한 원칙에 따라 루트-딥 23,24, 감염된 커널 시드 25,26, 및 표현형 레이스 타이핑을 위한 트레이-딥(22) 방법을 수정한 것에 대해 설명한다.

Protocol

1. 루트 딥 방법 (RDM)에 의한 레이스 결정 실험 환경의 준비 증상 표현은 환경 조건에 크게 의존하기 때문에 통제 된 지역에 식물을 유지하십시오. 상대 습도, 온도, 광주기 및 광도를 모니터링합니다(그림 1). 온도를 26-28 °C, 상대 습도를 50-75 %로 설정하고 적절한 식물 성장과 건강을 보장하기 위해 16 시간 광주기를 설정하십시오.참고 : 저산…

Representative Results

이러한 실험은 일반적으로 재배되는 품종의 상대적 저항을 정의하는 데 도움이됩니다 (표 1). 그런 다음 이 정보를 사용하여 지역 Fon 인구를 기반으로 관리 권장 사항을 안내할 수 있습니다. 즉, 인종 0 또는 1이 상업 분야에 존재하는 것으로 알려져 있다면, 농부는 칼훈 그레이, 선슈가 또는 이와 동등한 것과 같은 “내성적인”품종을 재배하는 경향이 있습니다. 모든 방법을 사용한 생물 …

Discussion

레이스 타이핑의 세 가지 방법이 제시되었습니다. 이러한 각 방법은 특정 질문 및 실험 조건에 가장 적합합니다. 감염된 커널 접종 방법 (토양 침입)은 아마도 더 간단하고 간단하여 병원성30의 평가에 특히 유용합니다. 간단한 레이스 타이핑을 위해이 방법을 사용하는 것이 매우 효과적입니다. 그러나 특정 품종의 저항력을 결정하는 방법을 적용하는 것은 각 식물이 동일한 정도…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 알리 박사와 식물 분자 진단 연구소뿐만 아니라 조지아 대학의 Pingsheng Ji 박사를 인정하고 싶습니다.이 박사의 리더십과 지원은 Fon 프로그램을 수립하는 데 도움이되었습니다.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
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Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
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