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Biologie

Um Contraste de Três Técnicas de Inoculação usado para determinar a raça do fusarium desconhecido oxysporum f.sp. niveum Isolados

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

Gerenciar o murmúrio fusarium de melancia requer o conhecimento das raças patógenas presentes. Aqui, descrevemos os métodos de inoculação de root-dip, infestado de kernel e métodos modificados de inoculação de mergulho de bandeja para demonstrar sua eficácia na digitação racial do fungo patogênico Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium murcha de melancia (Citrullus lanatus), causada por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ressurgiu como uma grande restrição de produção no sudeste dos EUA, especialmente na Flórida. A implantação de estratégias integradas de manejo de pragas, como cultivares resistentes à raça, requer informações sobre a diversidade e densidade populacional do patógeno nos campos dos produtores. Apesar de alguns progressos no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico molecular para identificar isolados de patógenos, a determinação racial muitas vezes requer abordagens de bioensação.

A digitação de raça foi conduzida por inoculação de mergulho radicular, método de semeadura infestada de kernel, e o método modificado de mergulho de bandeja com cada um dos quatro diferenciais de melancia (Diamante Negro, Cinza Charleston, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Os isolados recebem uma designação de raça por cálculo da incidência da doença cinco semanas após a inoculação. Se menos de 33% das plantas para uma cultivar específica fossem sintomáticas, elas eram categorizadas como resistentes. As cultivares com incidência superior a 33% foram consideradas suscetíveis. Este artigo descreve três métodos diferentes de inoculação para determinar raça, mergulho radicular, núcleo infestado e inoculação modificada de mergulho de bandeja, cujas aplicações variam de acordo com o design experimental.

Introduction

Os fungos soilborne que compõem o complexo de espécies de oxisporo fusarium oxysporum (FOSC) são patógenos hemibiotrópicos impactantes que podem causar doenças graves e perda de rendimento em uma variedade diversificada de culturas1. O murche fusarium de melancia, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), vem aumentando em escopo, incidência e gravidade em todo o mundo nas últimas décadas 2,3. Nas mudas, os sintomas do murche fusarium muitas vezes se assemelham a amortecimento. Em plantas mais antigas, a folhagem se torna cinza, clorolítica e necrótica. Eventualmente, a murcha das plantas progride para o colapso total da planta e a morte4. A perda direta de rendimento ocorre devido aos sintomas e morte da planta, enquanto a perda indireta de rendimento pode ocorrer devido aos danos solares causados pela eliminação do dossel foliar5. A reprodução sexual e as estruturas reprodutivas associadas nunca foram observadas em F. oxysporum. No entanto, o patógeno produz dois tipos de esporos assexuados, micro e macroconidia, bem como estruturas de sobrevivência maiores e de longo prazo chamadas clamídesporos, que podem sobreviver no solo por muitos anos6.

O FOSC é classificado em especial formae com base em faixas de hospedeiras observadas, geralmente limitadas a uma ou algumas espécieshospedeiras 1. Embora pesquisas recentes tenham indicado que este complexo de espécies pode ser um composto de 15 espécies diferentes, as espécies particulares que infectam a melancia são atualmente desconhecidas7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) é o nome dos grupos de cepas que infectam exclusivamente Citrullus lanatus ou a melancia domesticada 8,9. As cepas de f. oxysporum dentro da maioria das especialidades de forma patogênica mostram certos níveis de diversidade em relação aos seus componentes genéticos e virulência em relação a uma espécie hospedeira. Por exemplo, uma cepa pode infectar todas as cultivares de um hospedeiro, enquanto outra só pode infectar as cultivares mais suscetíveis. Para explicar essa variação, esses grupos são informalmente classificados em raças baseadas em relações evolutivas ou características fenotípicas comuns. Dentro de Fon, quatro raças (0, 1, 2 e 3) foram caracterizadas com base em sua patogenicidade contra um conjunto de cultivares de melancia selecionadas, com a descoberta da raça 3 ocorrendo recentemente10.

Apesar dessa aparente diversidade, as morfologias dos esporos ou hifas não são distinguíveis entre as raças das raças Fon, o que significa que ensaios moleculares ou fenotípicos são necessários para identificar a raça única de um isolado11. Pesquisas moleculares identificaram algumas diferenças genéticas. Por exemplo, o papel dos efeitos Secreted in Xylem (SIX) tem sido estudado há anos em F. oxysporum, e alguns desses efeitos foram localizados nos cromossomos trocados durante a transferência horizontal de genes12. Por exemplo, SIX6 é encontrado nas corridas 0 e 1 fon, mas não na corrida 213. Seis efeitos foram implicados na patogenicidade de F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, que causam murcha fusarium no tomate e banana, respectivamente 14,15,16,17. A análise de perfis de efeitos SEIS entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, o patógeno murcho fusarium no espinafre, permitiu uma classificação que reflete com precisão a diversidade genética e fenotípica18. No entanto, as diferenças entre os mecanismos de virulência das raças Fon não são atualmente totalmente compreendidas, e os ensaios moleculares desenvolvidos após seu uso mostraram resultados inconsistentes e imprecisos19. Portanto, os resultados fenotípicos dos ensaios de infecção são atualmente a melhor maneira de classificar isolados.

F. oxysporum inicialmente infecta hospedeiros através das raízes antes de subir o xilema20. Isso torna a inoculação direta das raízes de uma determinada cultivar hospedeira uma maneira eficaz de realizar a digitação racial e é a base dos métodos de inoculação de mergulho de raiz e de mergulho de bandeja21. Quando não infecta um hospedeiro, F. oxysporum reside no solo e pode permanecer adormecido por anos. Cultivares de melancia suscetíveis no solo de um campo de interesse é uma maneira de testar a presença de Fon. Expandir este método para incluir cultivares de diferentes níveis conhecidos de resistência no solo que é deliberadamente infestado com Fon também é uma boa maneira de realizar a digitação racial (Tabela 1) e é a base do método infestado de sementes de kernel. O método modificado de mergulho de bandeja é uma variação do método original de mergulho de bandeja que permite uma digitação de corrida de alto rendimento onde muitas plantas e isolados de campo podem ser investigados rapidamente22. Fatores importantes de um bioensaio de digitação rápida e bem-sucedida incluem o uso de cultivares que documentaram diferenças na resistência às diferentes raças de patógenos, garantindo que o inóculo seja biologicamente ativo e abundante durante a infecção, mantendo um ambiente propício para o patógeno e hospedeiro, e usando um sistema de classificação consistente para gravidade ou incidência da doença. Este artigo descreve o mergulho raiz23,24, semeamento infestadode 25,26, e métodos modificados de mergulho de bandeja22 para digitação de raça fenotípica com base nos princípios descritos acima.

Protocol

1. Determinando a raça por método de mergulho raiz (RDM) Preparação do ambiente experimental Como a expressão dos sintomas é altamente dependente das condições ambientais, mantenha plantas em uma área controlada. Monitore a umidade relativa, temperatura, fotoperíodo e intensidade da luz (Figura 1). Coloque a temperatura entre 26-28 °C, umidade relativa do ar para 50-75%, e estabeleça um fotoperíodo de 16 horas para garantir o cresciment…

Representative Results

Esses experimentos ajudam a definir a resistência relativa de cultivares comumente cultivadas (Tabela 1). Essas informações podem então ser usadas para orientar recomendações de gerenciamento com base nas populações locais de Fon. Em outras palavras, se a raça 0 ou 1 é conhecida por estar presente em um campo comercial, então o agricultor pode estar inclinado a crescer uma variedade “resistente” como Calhoun Gray, Sunsugar, ou equivalente. Os resultados dos bioensativos utilizando todos os mé…

Discussion

Três métodos de digitação racial foram apresentados. Cada um desses métodos é mais adequado para questões particulares e condições experimentais. O método de inoculação de kernel infestado (infestação do solo) é talvez mais simples e simples, tornando-o especialmente útil para a avaliação da patogenicidade30. Usar este método para digitação de raça simples é altamente eficaz. No entanto, a aplicação do método para determinar a resistência de uma cultivar específica pode…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de reconhecer o Dr. Ali e o Laboratório de Diagnóstico Molecular vegetal, bem como o Dr. Pingsheng Ji da Universidade da Geórgia, cuja liderança e apoio ajudaram a estabelecer nosso programa Fon.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
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Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
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