JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Контраст трех методов инокуляции, используемых для определения расы неизвестных Fusarium oxysporum f.sp. нивеум Изолирует

Published: October 28, 2021
doi:
10.3791/63181
, , , , , , , , ,
1Department of Plant Pathology,University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center,University of Florida, 4Horticultural Sciences Department,University of Florida, 5Tropical Research and Education Center,University of Florida, 6Department of Horticulture,University of Georgia

Summary

Управление фузариозным увяданием арбуза требует знания присутствующих рас патогенов. Здесь мы описываем методы посева корневых, зараженных ядер и модифицированных методов посева в лоток, чтобы продемонстрировать их эффективность в расовом типировании патогенного гриба Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Фузариозное увядание арбуза (Citrullus lanatus), вызванное Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), вновь появилось в качестве основного производственного ограничения в юго-восточной США, особенно во Флориде. Внедрение комплексных стратегий борьбы с вредителями, таких как устойчивые к расе сорта, требует информации о разнообразии и плотности популяции патогена на полях производителей. Несмотря на некоторый прогресс в разработке молекулярных диагностических инструментов для идентификации изолятов патогенов, определение расы часто требует подходов к биоанализу.

Типирование расы проводилось методом корневой прививки, метода зараженного ядра и модифицированного метода погружения в лоток с каждым из четырех арбузных дифференциалов (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Изолятам присваивается обозначение расы путем расчета заболеваемости через пять недель после прививки. Если менее 33% растений для конкретного сорта были симптоматическими, они были классифицированы как устойчивые. Те сорта, у которых заболеваемость превышает 33%, были признаны восприимчивыми. В этой статье описываются три различных метода инокуляции для определения расы, корнеплодства, зараженного ядра и модифицированной прививки в лотке, применение которых варьируется в зависимости от экспериментального проекта.

Introduction

Почвенные грибы, входящие в состав видового комплекса Fusarium oxysporum (FOSC), являются эффективными гемибиотрофными патогенами растений, которые могут вызывать серьезные заболевания и потерю урожая в различных культурах1. Фузариозное увядание арбуза, вызванное F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), за последние несколько десятилетий увеличилось по масштабам, заболеваемости и тяжести во всем мире 2,3. У рассады симптомы фузариозного увядания часто напоминают затухание. У старых растений листва становится серой, хлоротической и некротической. В конце концов, увядание растений прогрессирует до полного коллапса растений и смерти4. Прямая потеря урожая происходит из-за симптомов и гибели растений, в то время как косвенная потеря урожая может произойти из-за повреждения солнцем, вызванного устранением листового полога5. Половое размножение и связанные с ним репродуктивные структуры никогда не наблюдались у F. oxysporum. Однако патоген продуцирует два типа бесполодных спор, микро- и макроконидии, а также более крупные, долгосрочные структуры выживания, называемые хламидоспорами, которые могут выживать в почве в течение многих лет6.

FOSC классифицируется на специальные formae на основе наблюдаемых диапазонов хозяев, обычно ограниченных одним или несколькими видами-хозяевами1. Хотя недавние исследования показали, что этот видовой комплекс может состоять из 15 различных видов, конкретные виды, которые заражают арбуз, в настоящее время неизвестны7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) — название групп штаммов, которые заражают исключительно Citrullus lanatus или одомашненный арбуз 8,9. Штаммы F. oxysporum в большинстве патогенных специальных форм демонстрируют определенные уровни разнообразия в отношении их генетических компонентов и вирулентности по отношению к виду-хозяину. Например, один штамм может инфицировать все сорта хозяина, в то время как другой может заражать только более восприимчивые сорта. Чтобы учесть такие вариации, эти группы неофициально классифицируются по расам на основе эволюционных отношений или общих фенотипических характеристик. В пределах Фона четыре расы (0, 1, 2 и 3) были охарактеризованы на основе их патогенности по отношению к набору избранных сортов арбуза, причем открытие расы 3 произошло недавно10.

Несмотря на это кажущееся разнообразие, морфологии спор или гиф не различимы между расами фон, а это означает, что молекулярные или фенотипические анализы необходимы для идентификации уникальной расыизолята 11. Молекулярные исследования выявили некоторые генетические различия. Например, роль эффекторов Secreted in Xylem (SIX) изучалась в течение многих лет у F. oxysporum, и некоторые из этих эффекторов были расположены на хромосомах, которыми обменивались во время горизонтального переноса генов12. Например, SIX6 встречается в гонках Фон 0 и 1, но не в гонках 213. ШЕСТЬ эффекторов были вовлечены в патогенность F. oxysporum f. sp. lycopersici и F. oxysporum f. sp. cubense, которые вызывают увядание Fusarium на помидорах и бананах соответственно 14,15,16,17. Анализ SIX эффекторных профилей среди штаммов F. oxysporum f. sp. spiniciae, патогена Fusarium wilt на шпинате, позволил классифицировать, который точно отражает генетическое и фенотипическое разнообразие18. Однако различия между механизмами вирулентности рас фон в настоящее время не совсем понятны, а молекулярные анализы, разработанные при их использовании, показали противоречивые и неточные результаты19. Таким образом, фенотипические результаты анализов инфекции в настоящее время являются лучшим способом классификации изолятов.

F. oxysporum первоначально заражает хозяев через корни, прежде чем пробиться вверх по ксилеме20. Это делает прямую прививку корней данного сорта хозяина эффективным способом выполнения расового типирования и является основой методов корневой и лотковой инокуляции21. Когда F. oxysporum не заражает хозяина, он находится в почве и может оставаться в состоянии покоя в течение многих лет. Выращивание восприимчивых сортов арбуза в почве из области интересов является одним из способов проверки на наличие фона. Расширение этого метода за счет включения сортов различных известных уровней устойчивости в почве, которая преднамеренно заражена фоном, также является хорошим способом выполнения расового типирования (таблица 1) и является основой метода посева зараженных ядрами. Модифицированный метод погружения в лоток представляет собой вариацию оригинального метода погружения в лоток, который позволяет быстро исследовать много растений и полевых изолятов, где можно быстро исследовать многие растения и полевые изоляты22. Важными факторами быстрого и успешного биоанализа расового типирования являются использование сортов, которые имеют документально подтвержденные различия в устойчивости к различным расам патогенов, обеспечение того, чтобы инокулят был биологически активным и обильным во время инфекции, поддержание среды, благоприятной как для патогена, так и для хозяина, и использование последовательной системы оценки тяжести или заболеваемости. В настоящем документе описываются корнеплодные23,24, зараженные ядра25,26 и модифицированные методы погружения в лоток22 для фенотипического расового типирования, основанные на принципах, описанных выше.

Protocol

1. Определение расы методом root-dip (RDM) Подготовка экспериментальной среды Поскольку выраженность симптомов сильно зависит от условий окружающей среды, поддерживайте растения в контролируемой зоне. Мониторинг относительной влажности, температуры, фотопериода и интен?…

Representative Results

Эти эксперименты помогают определить относительную устойчивость обычно выращиваемых сортов (таблица 1). Эта информация затем может быть использована для руководства рекомендациями по управлению, основанными на местных популяциях Фон. Другими словами, если известно, что раса …

Discussion

Были представлены три метода набора гонки. Каждый из этих методов лучше всего подходит для конкретных вопросов и экспериментальных условий. Метод инвазии ядра (заражение почвой), возможно, является более простым и прямолинейным, что делает его особенно полезным для оценки патогенности…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить доктора Али и Лабораторию молекулярной диагностики растений, а также доктора Пиншэн Джи из Университета Джорджии, чье руководство и поддержка помогли создать нашу программу Фон.

Materials

100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed – Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed – Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  6. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  7. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  8. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  9. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  10. Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
  11. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  12. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  13. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  14. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  15. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  16. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  17. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  18. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  19. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  20. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  21. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  22. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  23. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  24. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  25. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  26. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  27. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  28. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  29. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  30. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
  31. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  32. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  33. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  34. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  35. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  36. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  37. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  38. Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  39. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  40. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  41. Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  42. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  43. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  44. O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  45. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  46. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Fusarium WiltRace-typingBioassayInoculationWatermelonPathogenDisease ManagementPlant HealthV8 Juice MediumPotato Dextrose AgarConidiaSpore QuantificationBleachPlantletsRoot Rinsing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image