Un contraste de tres técnicas de inoculación utilizadas para determinar la raza de Fusarium oxysporum f.sp. desconocido niveum Aislantes

Summary

El manejo del marchitamiento por Fusarium de la sandía requiere el conocimiento de las razas de patógenos presentes. Aquí, describimos los métodos de inoculación de inmersión de raíz, semilla de grano infestado y inoculación de inmersión en bandeja modificados para demostrar su eficacia en la tipificación racial del hongo patógeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

El marchitamiento por Fusarium de sandía (Citrullus lanatus), causado por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ha resurgido como una importante restricción de producción en el sureste de los Estados Unidos, especialmente en Florida. El despliegue de estrategias integradas de manejo de plagas, como los cultivares resistentes específicos de la raza, requiere información sobre la diversidad y la densidad de población del patógeno en los campos de los cultivadores. A pesar de algunos avances en el desarrollo de herramientas de diagnóstico molecular para identificar aislados de patógenos, la determinación de la raza a menudo requiere enfoques de bioensayo.

La tipificación de la raza se llevó a cabo mediante inoculación por inmersión de raíz, método de siembra de grano infestado y el método modificado de inmersión en bandeja con cada uno de los cuatro diferenciales de sandía (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). A los aislados se les asigna una designación de raza mediante el cálculo de la incidencia de la enfermedad cinco semanas después de la inoculación. Si menos del 33% de las plantas de un cultivar en particular eran sintomáticas, se clasificaban como resistentes. Aquellos cultivares con incidencia superior al 33% fueron considerados susceptibles. Este artículo describe tres métodos diferentes de inoculación para determinar la raza, la inmersión de la raíz, el núcleo infestado y la inoculación modificada de la inmersión en bandeja, cuyas aplicaciones varían según el diseño experimental.

Introduction

Los hongos transmitidos por el suelo que componen el complejo de especies de Fusarium oxysporum (FOSC) son patógenos hemibiotróficos de plantas impactantes que pueden causar enfermedades graves y pérdida de rendimiento en una amplia gama de cultivos¹. El marchitamiento por Fusarium de la sandía, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), ha aumentado en alcance, incidencia y gravedad en todo el mundo en las últimas décadas ^2,3. En las plántulas, los síntomas del marchitamiento por Fusarium a menudo se asemejan a la amortiguación. En las plantas más viejas, el follaje se vuelve gris, clorótico y necrótico. Eventualmente, el marchitamiento de las plantas progresa hasta el colapso total de la planta y la muerte⁴. La pérdida directa de rendimiento se produce debido a los síntomas y la muerte de la planta, mientras que la pérdida indirecta de rendimiento puede ocurrir debido al daño solar causado por la eliminación del dosel foliar⁵. La reproducción sexual y las estructuras reproductivas asociadas nunca se han observado en F. oxysporum. Sin embargo, el patógeno produce dos tipos de esporas asexuales, micro y macroconidios, así como estructuras de supervivencia más grandes a largo plazo llamadas clamidosporas, que pueden sobrevivir en el suelo durante muchos años⁶.

El FOSC se clasifica en formae speciales en función de los rangos de huéspedes observados, generalmente limitados a una o unas pocas especies huésped¹. Aunque investigaciones recientes han indicado que este complejo de especies puede ser un compuesto de 15 especies diferentes, las especies particulares que infectan la sandía son actualmente desconocidas⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) es el nombre de los grupos de cepas que infectan exclusivamente a Citrullus lanatus o a la sandía domesticada ^8,9. Las cepas de F. oxysporum dentro de la mayoría de las formas especiales patógenas muestran ciertos niveles de diversidad con respecto a sus componentes genéticos y virulencia hacia una especie huésped. Por ejemplo, una cepa puede infectar a todos los cultivares de un huésped, mientras que otra solo puede infectar a los cultivares más susceptibles. Para dar cuenta de tal variación, estos grupos se clasifican informalmente en razas basadas en relaciones evolutivas o características fenotípicas comunes. Dentro de Fon, se han caracterizado cuatro razas (0, 1, 2 y 3) en función de su patogenicidad contra un conjunto de cultivares de sandía seleccionados, con el descubrimiento de la raza 3 ocurriendo recientemente¹⁰.

A pesar de esta aparente diversidad, las morfologías de las esporas o hifas no son distinguibles entre las razas de las razas Fon, lo que significa que se necesitan ensayos moleculares o fenotípicos para identificar la raza única de un aislado¹¹. La investigación molecular ha identificado algunas diferencias genéticas. Por ejemplo, el papel de Secreted en los efectores del xilema (SIX) se ha estudiado durante años en F. oxysporum, y algunos de estos efectores se han localizado en los cromosomas intercambiados durante la transferencia horizontal^{de genes 12}. Por ejemplo, SIX6 se encuentra en las carreras Fon 0 y 1, pero no en la carrera 2¹³. SEIS efectores han sido implicados en la patogenicidad de F. oxysporum f. sp. lycopersici y F. oxysporum f. sp. cubense, que causan marchitamiento por Fusarium en tomate y plátano, respectivamente 14,15,16,17. El análisis de seis perfiles efectores entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, el patógeno del marchitamiento por Fusarium en espinacas, ha permitido una clasificación que refleja con precisión la diversidad genética y fenotípica¹⁸. Sin embargo, las diferencias entre los mecanismos de virulencia de las razas Fon actualmente no se comprenden completamente, y los ensayos moleculares desarrollados sobre su uso han mostrado resultados inconsistentes e inexactos¹⁹. Por lo tanto, los resultados fenotípicos de los ensayos de infección son actualmente la mejor manera de clasificar los aislados.

F. oxysporum inicialmente infecta a los huéspedes a través de las raíces antes de abrirse camino hacia el xilema²⁰. Esto hace que la inoculación directa de las raíces de un cultivar huésped dado sea una forma efectiva de realizar la tipificación de la raza y es la base de los métodos de inoculación de inmersión de raíz y inmersión en bandeja²¹. Cuando no infecta a un huésped, F. oxysporum reside en el suelo y puede permanecer inactivo durante años. Cultivar cultivares de sandía susceptibles en el suelo de un campo de interés es una forma de probar la presencia de Fon. Ampliar este método para incluir cultivares de diferentes niveles conocidos de resistencia en suelos que están infestados deliberadamente con Fon también es una buena manera de realizar la tipificación de razas (Tabla 1) y es la base del método de siembra de granos infestados. El método modificado de inmersión en bandeja es una variación del método original de inmersión en bandeja que permite una tipificación de carrera de alto rendimiento donde muchas plantas y aislados de campo se pueden investigar rápidamente²². Los factores importantes de un bioensayo rápido y exitoso de tipificación de razas incluyen el uso de cultivares que han documentado diferencias en la resistencia a las diferentes razas de patógenos, asegurando que el inóculo sea biológicamente activo y abundante durante la infección, manteniendo un ambiente que sea propicio para el patógeno y el huésped, y utilizando un sistema de calificación consistente para la gravedad o incidencia de la enfermedad. Este artículo describe los métodos^{root-dip 23,24}, infested kernel seeding^25,26 y modified tray-dip²² métodos para la tipificación fenotípica de razas basados en los principios descritos anteriormente.

Protocol

1. Determinación de la raza por el método de inmersión de la raíz (RDM) Preparación del entorno experimental Debido a que la expresión de los síntomas depende en gran medida de las condiciones ambientales, mantenga las plantas en un área controlada. Monitoree la humedad relativa, la temperatura, el fotoperíodo y la intensidad de la luz (Figura 1). Ajuste la temperatura a 26-28 ° C, la humedad relativa a 50-75% y establezca un fotoperíodo …

Representative Results

Estos experimentos ayudan a definir la resistencia relativa de los cultivares comúnmente cultivados (Tabla 1). Esta información se puede utilizar para guiar las recomendaciones de gestión basadas en las poblaciones locales de Fon. En otras palabras, si se sabe que la raza 0 o 1 está presente en un campo comercial, entonces el agricultor puede estar inclinado a cultivar una variedad “resistente” como Calhoun Gray, Sunsugar o equivalente. Los resultados de los bioensayos utilizando todos los métodos m…

Discussion

Se han presentado tres métodos de tipificación de razas. Cada uno de estos métodos se adapta mejor a preguntas particulares y condiciones experimentales. El método de inoculación del grano infestado (infestación del suelo) es quizás más simple y directo, por lo que es especialmente útil para la evaluación de la patogenicidad³⁰. El uso de este método para escribir carreras simples es altamente efectivo. Sin embargo, aplicar el método para determinar la resistencia de un cultivar especí…

Materials

100% Fuller’s Earth	Sigma-Aldrich	F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask	PYREX	4980-1L
15 mL falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
50 mL graduated cylinder	Lab Safety Supply	41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes	Fisher Scientific	05-413-921
Aluminum foil wrap	Reynolds Wrap	720
Bleach	Walmart	587192290
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-391-301
CaCO3	sigma-Aldrich	239216
cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-11
Cheesecloth	Lions Services, Inc	8305-01-125-0725
Clear plastic dishes	Visions Wave	999RP6CLSS	~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	Sterile
Ethanol	Fisher Chemical	A4094	100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights	MaxLume	Model T5	2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar	VWR International	90000-786
Hand-held Spray Bottle	Ability One	24122002	~0.95 L
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-55A	Two chamber hemacytometer
Lab trays	Fisher Scientific	15-236-2A
Large, sealable plastic bags	Ziploc	430805	38 cm x 38 cm
Mister / watering can	Bar5F	B10H22
Mushroom Bag Clamp	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D
Organic Rye Berries	Shroom Supply		0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips	Fisher Scientific	14-388-100
Petri dishes	Fisherbrand	FB0875713	Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
Plastic Pitcher	BrandTech	UX0600850	1 L or larger
Plastic planting pots	Neo/SCI	01-1177	~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin	Thermo Scientific	UX0601022	3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media	Cole-Parmer	UX1420028	Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g	Ohaus	30208458	Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore	Cole-Parmer	NC9585352
Small Mushroom grow bag	Shroom Supply		0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel	Walmart	563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells)	Speedling	Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells)	Speedling	Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL)	fisher Scientific	14-829-19C
Timer	Walmart	TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice	Walmart	564638212
vortex	Fisher Scientific	02-215-418
Watermelon Seed – Black Diamond	Willhite Seed Inc	17
Watermelon Seed – Calhoun Gray	Holmes Seed Company	4440
Watermelon Seed – Charleston Gray	Bonnie Plants	7.15339E+11
Watermelon Seed – PI 296341-FR	Contact authors	Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional)	Alachua County Feed & Seed