Ein Kontrast von drei Impftechniken, die verwendet werden, um die Rasse von unbekanntem Fusarium oxysporum f.sp. Niveum Isoliert
Summary
Die Behandlung der Fusariumwelke der Wassermelone erfordert die Kenntnis der vorhandenen Erregerrassen. Hier beschreiben wir die Root-Dip-, befallenen Kernaussaat- und modifizierten Tray-Dip-Impfmethoden, um ihre Wirksamkeit bei der Rassentypisierung des pathogenen Pilzes Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon) nachzuweisen.
Abstract
Die Fusariumwelke der Wassermelone (Citrullus lanatus), verursacht durch Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ist im Südosten der USA, insbesondere in Florida, wieder zu einem wichtigen Produktionsdruck geworden. Der Einsatz integrierter Schädlingsbekämpfungsstrategien, wie z. B. rassenspezifische resistente Sorten, erfordert Informationen über die Vielfalt und Populationsdichte des Erregers auf den Feldern der Erzeuger. Trotz einiger Fortschritte bei der Entwicklung molekulardiagnostischer Instrumente zur Identifizierung von Pathogenisolaten erfordert die Rassenbestimmung häufig Bioassay-Ansätze.
Die Rassentypisierung wurde durch Wurzel-Dip-Impfung, befallene Kernaussaatmethode und die modifizierte Tray-Dip-Methode mit jedem der vier Wassermelonendifferentiale (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR) durchgeführt. Isolate erhalten durch Berechnung der Krankheitsinzidenz fünf Wochen nach der Impfung eine Rassenbezeichnung. Wenn weniger als 33% der Pflanzen für eine bestimmte Sorte symptomatisch waren, wurden sie als resistent eingestuft. Diejenigen Sorten mit einer Inzidenz von mehr als 33% wurden als anfällig angesehen. Dieses Papier beschreibt drei verschiedene Methoden der Impfung zur Bestimmung von Rasse, Wurzel-Dip, befallenem Kern und modifizierter Tray-Dip-Impfung, deren Anwendungen je nach experimentellem Design variieren.
Introduction
Die bodenbürtigen Pilze, aus denen der Fusarium oxysporum species complex (FOSC) besteht, sind wirkungsvolle hemibiotrophe Pflanzenpathogene, die bei einer Vielzahl von Kulturen schwere Krankheiten und Ertragsverluste verursachen können1. Die durch F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) verursachte Fusariumwelke der Wassermelone hat in den letzten Jahrzehnten weltweit an Umfang, Häufigkeit und Schweregrad zugenommen 2,3. Bei Sämlingen ähneln die Symptome der Fusariumwelke oft einer Dämpfung. Bei älteren Pflanzen wird das Laub grau, chlorotisch und nekrotisch. Schließlich schreitet das Welken der Pflanzen zum vollständigen Zusammenbruch der Pflanze und zum Todfort 4. Direkter Ertragsverlust tritt aufgrund der Symptome und des Pflanzentodes auf, während indirekter Ertragsverlust aufgrund von Sonnenschäden auftreten kann, die durch die Beseitigung des Blattdaches verursachtwerden 5. Sexuelle Fortpflanzung und damit verbundene Fortpflanzungsstrukturen wurden bei F. oxysporum nie beobachtet. Der Erreger produziert jedoch zwei Arten von asexuellen Sporen, Mikro- und Makrokonidien, sowie größere, langfristige Überlebensstrukturen, die als Chlamydosporen bezeichnet werden und viele Jahre im Boden überleben können6.
Das FOSC wird basierend auf beobachteten Wirtsbereichen in Formae speciales eingeteilt, die normalerweise auf eine oder wenige Wirtsartenbeschränkt sind 1. Obwohl jüngste Forschungen darauf hindeuten, dass dieser Artenkomplex eine Zusammensetzung von 15 verschiedenen Arten sein könnte, sind die besonderen Arten, die Wassermelonen infizieren, derzeit unbekannt7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) ist der Name für die Gruppen von Stämmen, die ausschließlich Citrullus lanatus oder die domestizierte Wassermelone 8,9 befallen. F. oxysporum-Stämme innerhalb der meisten pathogenen Formae speciales weisen ein gewisses Maß an Diversität in Bezug auf ihre genetischen Komponenten und ihre Virulenz gegenüber einer Wirtsart auf. Zum Beispiel kann ein Stamm alle Sorten eines Wirts infizieren, während ein anderer nur die anfälligeren Sorten infizieren kann. Um eine solche Variation zu berücksichtigen, werden diese Gruppen informell in Rassen eingeteilt, die auf evolutionären Beziehungen oder gemeinsamen phänotypischen Merkmalen basieren. Innerhalb von Fon wurden vier Rassen (0, 1, 2 und 3) basierend auf ihrer Pathogenität gegen eine Reihe ausgewählter Wassermelonensorten charakterisiert, wobei die Entdeckung von Rasse 3 kürzlich10 stattfand.
Trotz dieser scheinbaren Vielfalt sind die Morphologien von Sporen oder Hyphen zwischen den Rassen der Fon-Rassen nicht unterscheidbar, was bedeutet, dass molekulare oder phänotypische Assays benötigt werden, um die einzigartige Rasse eines Isolatszu identifizieren 11. Die molekulare Forschung hat einige genetische Unterschiede identifiziert. Zum Beispiel wurde die Rolle von Secreted in Xylem (SIX) -Effektoren seit Jahren in F. oxysporum untersucht, und einige dieser Effektoren wurden auf den Chromosomen lokalisiert, die während des horizontalen Gentransfers ausgetauschtwurden 12. Zum Beispiel ist SIX6 in den Fon-Rennen 0 und 1 zu finden, aber nicht in Rennen 213. SIX Effektoren wurden mit der Pathogenität von F. oxysporum f. sp. lycopersici und F. oxysporum f. sp. cubense in Verbindung gebracht, die Fusariumwelke auf Tomaten bzw.Bananen verursachen 14,15,16,17. Die Analyse von SIX-Effektorprofilen unter Stämmen von F. oxysporum f. sp. spiniciae, dem Fusarium-Welkeserreger auf Spinat, hat eine Klassifizierung ermöglicht, die die genetische und phänotypische Vielfalt genau widerspiegelt18. Die Unterschiede zwischen den Virulenzmechanismen von Fon-Rassen sind jedoch derzeit nicht vollständig verstanden, und molekulare Assays, die bei ihrer Verwendung entwickelt wurden, haben inkonsistente und ungenaue Ergebnissegezeigt 19. Daher sind phänotypische Ergebnisse von Infektionsassays derzeit der beste Weg, um Isolate zu klassifizieren.
F. oxysporum infiziert zunächst Wirte durch die Wurzeln, bevor es sich auf den Weg zum Xylem20 macht. Dies macht die direkte Inokulation der Wurzeln einer bestimmten Wirtssorte zu einer effektiven Möglichkeit, eine Rassentypisierung durchzuführen, und ist die Grundlage der Wurzel-Dip- und Tray-Dip-Impfmethoden21. Wenn ein Wirt nicht infiziert wird, befindet sich F. oxysporum im Boden und kann jahrelang inaktiv bleiben. Der Anbau anfälliger Wassermelonensorten im Boden aus einem Interessengebiet ist eine Möglichkeit, auf das Vorhandensein von Fon zu testen. Die Erweiterung dieser Methode auf Sorten mit unterschiedlichen bekannten Widerstandsniveaus in Böden, die absichtlich mit Fon befallen sind, ist auch eine gute Möglichkeit, eine Rassentypisierung durchzuführen (Tabelle 1) und ist die Grundlage der befallenen Kernaussaatmethode. Die modifizierte Tray-Dip-Methode ist eine Variation der ursprünglichen Tray-Dip-Methode, die eine Hochdurchsatz-Renntypisierung ermöglicht, bei der viele Pflanzen und Feldisolate schnell untersucht werdenkönnen 22. Zu den wichtigen Faktoren eines schnellen und erfolgreichen rassentypisierenden Bioassays gehören die Verwendung von Sorten, die Unterschiede in der Resistenz gegen die verschiedenen Erregerrassen aufweisen, die Sicherstellung, dass das Inokulum während der Infektion sowohl biologisch aktiv als auch reichlich vorhanden ist, die Aufrechterhaltung einer Umgebung, die sowohl für den Erreger als auch für den Host förderlich ist, und die Verwendung eines konsistenten Bewertungssystems für die Schwere oder Inzidenz der Erkrankung. Dieses Papier beschreibt die Root-Dip23,24, die befallene Kernaussaat 25,26 und modifizierte Tray-Dip 22-Methoden für die phänotypische Rassentypisierung basierend auf den oben beschriebenen Prinzipien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drei Methoden der Rassentypisierung wurden vorgestellt. Jede dieser Methoden eignet sich am besten für bestimmte Fragestellungen und experimentelle Bedingungen. Die befallene Kernimpfmethode (Bodenbefall) ist vielleicht einfacher und unkomplizierter, was sie besonders nützlich für die Beurteilung der Pathogenitätmacht 30. Die Verwendung dieser Methode für einfaches Renntypisieren ist sehr effektiv. Die Anwendung der Methode zur Bestimmung der Resistenz einer bestimmten Sorte könnte jedoch ei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Ali und dem Plant Molecular Diagnostic Laboratory sowie Dr. Pingsheng Ji von der University of Georgia danken, deren Leitung und Unterstützung zur Etablierung unseres Fon-Programms beigetragen haben.
Materials
| 100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
| 1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
| 50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
| Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
| Bleach | Walmart | 587192290 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
| CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
| cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
| Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
| Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
| Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
| Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
| Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
| granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
| Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
| Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
| Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
| Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
| Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
| Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
| P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
| Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
| Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
| Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
| Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
| Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
| Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
| Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
| Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
| Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
| Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
| Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
| Timer | Walmart | TM-01 | |
| V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
| vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
| Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
| Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
| Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
| Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
| Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |
References
- Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
- Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
- Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , 136-156 (2012).
- Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
- Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
- Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
- Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
- Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
- Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium laboratory manual. , (2008).
- Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
- Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
- Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
- Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
- Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
- Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
- Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
- Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
- Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
- Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
- Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
- Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
- Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
- Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
- Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
- Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
- Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
- Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
- Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
- Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. . Basic plant pathology methods. , (2017).
- Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
- Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
- Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
- Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
- Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
- Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
- Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
- Chiang, K. -. S., Bock, C. H., Lee, I. -. H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
- Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
- Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
- Lin, Y. -. H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
- van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
- Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
- O’Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
- Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
- Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).
