Denna artikel ger detaljerade protokoll för att orsaka penetrerande traumatisk hjärnskada (PTBI) till vuxna Drosophila och undersöka den resulterande neurogenes.
De molekylära och cellulära mekanismerna bakom neurogenes som svar på sjukdom eller skada är inte väl förstådda. Att förstå dessa mekanismer är dock avgörande för att utveckla neurala regenerativa terapier. Drosophila melanogaster är en ledande modell för studier av neural utveckling men har historiskt inte utnyttjats för att undersöka vuxen hjärnregenerering. Detta beror främst på att den vuxna hjärnan uppvisar mycket låg mitotisk aktivitet. Ändå utlöser genomträngande traumatisk hjärnskada (PTBI) till den vuxna Drosophila centrala hjärnan genereringen av nya nervceller och nya glia. De kraftfulla genetiska verktygen som finns i Drosophila i kombination med det enkla men rigorösa skadeprotokollet som beskrivs här gör nu vuxen Drosophila hjärna till en robust modell för neural regenereringsforskning. Här finns detaljerade instruktioner för (1) genomträngande skador på den vuxna centrala hjärnan och (2) dissekering, immunohistokemi och bildbehandling efter skada. Dessa protokoll ger mycket reproducerbara resultat och kommer att underlätta ytterligare studier för att dissekera mekanismer som ligger till grund för neural regenerering.
Skador på hjärnan och nervsystemet är en viktig orsak till dödsfall och funktionshinder över hela världen. Cirka 1,5 miljoner amerikaner drabbas av traumatiska hjärnskador (TBI) varje år1, medan uppskattningsvis 6 miljoner individer bara i USA lider av neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons och Alzheimers sjukdom2. Både sjukdom och skada på hjärnan kan orsaka neural degeneration, vilket leder till sensoriska, kognitiva och motoriska defekter3. Att utveckla terapeutiska strategier för mänsklig hjärnreparation har varit svårt på grund av hjärnans komplexa fysiologi. Modellorganismer som Drosophila melanogaster ger ett enkelt system för att identifiera de grundläggande mekanismerna bakom neurodegeneration och potentiella terapeutiska mål4.
Fruktflugan Drosophila melanogaster har varit en kraftfull modellorganism i mer än ett sekel och avancerar inom genetik, utvecklingsbiologi och neurovetenskap5,6. Drosophila hjärnan består endast ~ 90,000 nervceller7, en miljon gånger färre än den genomsnittliga mänskliga hjärnan8, men de har många likheter. Både mänskliga och flughjärnor använder signalsubstanserna GABA, glutamat, acetylkolin, och biogena aminer dopamin och serotonin9. Drosophila och mänskliga nervceller fungerar också på samma sätt, med en delad synaptisk arkitektur och analoga neurala celltyper10. Den mindre hjärnstorleken hos Drosophila och tillgången till avancerade genetiktekniker, i kombination med bevarandet av molekylära, cellulära och fysiologiska mekanismer mellan Drosophila och däggdjur, tillåter Drosophila-forskare att ställa frågor som är opraktiska eller svåra att svara på i däggdjursmodeller.
Vår nuvarande förståelse för vuxna neurogenes i Drosophila, både under homeostas och efter skada, är fortfarande begränsad. Mer är känt om neurogenes under normal utveckling. Till exempel skapas nervceller och glia under utveckling från prekursorceller, så kallade neuroblaster10,11. Minst tre olika typer av neuroblaster har särskiljts i den centrala hjärnan. Både typ I och typ II härstamning neuroblaster lämnar cellcykeln ~20-30 h efter pupariumbildning12. Däremot är svampkroppens neuroblaster de sista som avslutar celldelningen och gör det via Reaper-beroende apoptos ~ 85-90 h efter pupariumbildning13. Efter eklosion har den vuxna Drosophila hjärnan få delningsceller (~ 1 cell / hjärna), främst glia14. De vuxna optiska lober har långsamt cykling neuroblaster som kan neurogenes15, medan den vuxna centrala hjärnan har inga kända neuroblaster. Bristen på neurala stamceller och begränsad cellproliferation liknar starkt situationen i den vuxna däggdjurshjärnan, vilket understryker den potentiella relevansen av mekanismerna hos vuxna neurogenes i Drosophila för människor.
Upptäckten av låga nivåer av vuxna neurogenes i vuxna Drosophila optik lober efter skada15 ledde till hypotesen att den vuxna Drosophila centrala hjärnan också kan vara kapabel till vuxna neurogenes16. Detta protokoll beskriver att skapa en rigorös, reproducerbar modell av centrala hjärnan skada i vuxna Drosophila som kan användas för att undersöka neurogenes i den vuxna centrala hjärnan. Med tanke på likheterna mellan mänsklig och Drosophila hjärnans arkitektur och funktion, kan dessa upptäckter leda till identifiering av kritiska mål för terapeutisk neurogenes i skadade och sjuka mänskliga hjärnor.
Även om genomträngande skador på den vuxna Drosophila hjärnan har beskrivits tidigare15,17,18, dessa skador fokuserade på optik lober och inte den centrala hjärnan. Dessutom saknas detaljerade instruktioner för hur skadorna ska utföras. Detta protokoll beskriver en modell för penetrerande skada på den vuxna Drosophila centrala hjärnan som reproducerar statistiskt signifikanta bevis för vuxna neurogenes efter PTBI.
Reproducerbarheten av detta PTBI protokoll beror delvis på svamp kroppen som skada mål region. Svampkroppen är stor, bestående av ~ 2200 nervceller med komplexa dendrit och axon arbors i stora och mycket stereotypa matriser18. Cellkropparna av svampkroppsneuroner ligger nära hjärnans yta och kan visualiseras genom huvud nagelbandet med hjälp av uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP) (figur 1C). Svampkroppsprekursorer är de sista neurala stamcellerna som genomgår apoptos under utveckling13,12,19. Således är många svampkroppsneuroner ganska unga vid tidpunkten för eklosion. Detta ledde till hypotesen att svampkroppen kan ha mer mitotisk potential än andra hjärnregioner16. Dessutom är svampkroppen avgörande för lärande och minne18. Detta gör att man kan fråga om PTBI-utlöst neurogenes leder till funktionell återhämtning.
Andra faktorer som bidrar till resultatens reproducerbarhet inkluderar att använda utkorsade flugor av konsekventa genotyper, utföra kors i samma riktning varje gång, exakt kontrollera uppfödnings- och åldringstemperaturerna och analysera män och kvinnor separat. Att använda F1-flugor från en outcross minskar sannolikheten för att analysera hjärnor homozygous för spontana mutationer. Det standart argt av y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 vuxna kvinnlig till y[1] w[1] vuxna maleflugor resulterar i F1 avkomma av genotypen y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 uttrycks i alla inneboende nervceller i svampkroppen och driver uttryck för den membranbundna reportern UAS-mCD8-GFP tillåter visualisering av svampkroppar och deras projektioner. För perma-twin-korsen skall korsen alltid ligga kvar vid 17 °C för att hålla härstamningssystemet avstängt. Detta säkerställer att inga delningsceller märks under utvecklingen och att endast vuxenfödda nervceller och glia är märkta. För detta ändamål kan flygrummet också bibehållas vid 17 °C. Även om den första beskrivningen av perma-twin systemet15 rekommenderade uppfödning flyger vid 18 °C, kan detta leda till betydande bakgrundsmärkning.
För konsistens rekommenderas också att hålla kontrollen oskadda flugor på CO2-kudden när man utför PTBI. Detta säkerställer att båda uppsättningarna av flugor har identisk anestesiexponering. Dessutom är det önskvärt att reproducerbarheten helt tränger in i huvudet. Man måste dock vara försiktig så att stiftets spets inte böjs mot dynan, vilket gör den oanvändbar för framtida skador. För skickliga utövare finns det lite oavsiktlig skada på PTBI-flugor. Ändå kan det vara dödligt att trycka för hårt på bröstkorgen för att stabilisera flugan under skada. Ett sätt att bedöma omfattningen av den oavsiktliga skadan är att kvantifiera dödligheten hos PTBI flyger 24 timmar efter skadan. För ensidigt skadade flugor kan detta vara 50% eller högre för nybörjare. För att säkerställa att observerade resultat beror på PTBI och inte oavsiktlig skada, rekommenderas därför att nybörjare övar på att administrera PTBI på ~ 20 flugor dagligen under flera veckor och analyserar inte de resulterande hjärnorna förrän 24 h dödligheten konsekvent <10%.
För att kvantifiera mängden spridning stimuleras av centrala hjärnan PTBI, både anti-phosphohistone H3 (PH3) immunostaining och 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) införlivande kan användas. Anti-PH3 etiketterar celler före och genom metafas, vilket begränsar detektion till endast en bråkdel av de aktivt delande cellerna. Således ger anti-PH3 färgning bara en partiell glimt av spridning. EdU är en tymidinanalog som kan införlivas i nysyntetiserat DNA. Genom att mata flugor EdU före och efter skada är det möjligt att få en mer fullständig bild av cellerna som antingen delar sig eller har delats efter skadan. Det faktum att alla celler som delar sig är permanent markerade är till hjälp både för identifiering av långsamt cyklande celler och analysera cellernas överlevnad efter den första spridningen. Av oklara skäl, men kanske på grund av begränsad permeabilitet av blod – hjärnbarriären, EdU märkning är ineffektiv och underrapporterar cellproliferation i den vuxna hjärnan. Detta framgår av liknande antal PH3 + och EdU + celler i både kontroll och experimentella hjärnor vid 24 h post-PTBI och genom att observera att endast en delmängd av nya celler i perma-twin kloner införlivar EdU16. För maximal märkning är det viktigt att förmata flugorna med EdU eftersom skadade flugor inte återupptar utfodringen i flera timmar efter PTBI. Utfodring bedömdes genom att tillsätta matfärgning till EdU-lösningen och övervaka mängden färgämne i tarmen genom buk nagelbandet16.
Det bör noteras att medan vi har tillhandahållit ett hjärn dissekeringsprotokoll i steg 4, kan alternativa tekniker användas. Flera av dessa finns i tidigare publicerade protokoll20,21,22. Drosophila melanogaster erbjuder en billig modell med kraftfulla genetiska och molekylära verktyg som kan användas för att studera mekanismerna bakom regenerering av flera vävnader, inklusive tarmen och komponenter i nervsystemet. En ny och reproducerbar skademodell som kan användas för att studera svaret på hjärnskada beskrivs här. Data som erhållits med hjälp av dessa protokoll stöder tanken att den vuxna Drosophila centrala hjärnan behåller den proliferativa förmågan, genererar nya nervceller som svar på skada. Dessa observationer motiverar ytterligare undersökning av både omfattningen av vuxna neurogenesis och dess underliggande molekylära mekanismer. När komponenterna som är involverade i neural regenerering identifieras i detta system kan vi konvertera vår kunskap om vuxna Drosophila neurogenes till människor.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Stacey Rimkus och Becky Katzenberger för tekniskt bistånd och Eduardo Moreno för att de delar perma-twin-bestånden. Vi vill tacka Barry Ganetzky och David Wassarman för livliga diskussioner som utan tvekan förbättrade vetenskapen och Kent Mok, Cayla Guerra och Bailey Spiegelberg för deras bidrag till laboratoriet. FasII-antikropparna utvecklades av Corey Goodman och erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank, skapad av NICHD av NIH och underhålls vid University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. De flesta av de Drosophila stammar som användes i denna studie erhölls från Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Detta arbete stöddes av NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Universitetar av Wisconsin forskarutbildning (GBF); och UW-Madison Women in Science and Engineering Leadership Institute (WISELI) (GBF).
#11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
CO2 bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
CO2 regulator and supply | any | for anesthesia | |
Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
Microscope slides | any | for mounting brains | |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |