न्यूरोप्लास्टी को उलटने और चूहों में कोकीन की मांग को रोकने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करना
Summary
यहां वर्णित विधियां चूहों में व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक सर्किट में कोकेन-प्रेरित प्लास्टिसिटी को ऑप्टोजेनेटिक रूप से रिवर्स करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को रेखांकित करती हैं। थैलेमो-एमिग्डाला सिनैप्स की निरंतर कम आवृत्ति ऑप्टिकल उत्तेजना दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड) को प्रेरित करती है। कोकेन-अनुभवी चूहों में विवो ऑप्टोजेनेटिकली-प्रेरित लिमिटेड में क्यू-प्रेरित दवा की मांग के बाद क्षीणन हुआ।
Abstract
यह प्रोटोकॉल चूहे में बाद में कोकीन की मांग के व्यवहार को कम करने के लिए थैलेमो-एमिग्डाला सर्किट पर कोकीन-प्रेरित प्लास्टिसिटी को उलटने के लिए ऑप्टोजेनेटिक टूल का उपयोग करने के लिए आवश्यक कदमों को प्रदर्शित करता है। हमारे शोध में, हमने पाया था कि जब चूहे एक ऑडियोविज़ुअल क्यू के साथ जोड़े गए अंतःशिरा कोकीन को स्व-प्रशासित करते हैं, तो थैलेमस (एमजीएन) के मेडियल जेनिकुलेट न्यूक्लियस से लेटरल एमिग्डाला (एलए) के प्रमुख न्यूरॉन्स पर इनपुट पर बनने वाले सिनैप्स मजबूत हो जाते हैं क्योंकि क्यू-कोकीन एसोसिएशन सीखा जाता है। हमने अनुमान लगाया कि इन सिनैप्स में कोकीन-प्रेरित प्लास्टिसिटी के उलट से क्यू-प्रेरित कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार में कमी आएगी। विवो में इस प्रकार के न्यूरोमॉड्यूलेशन को पूरा करने के लिए, हम सिनैप्टिक दीर्घकालिक अवसाद (LTD) को प्रेरित करना चाहते थे, जो MGN-LA सिनैप्स की ताकत को कम करता है। इसके लिए, हमने ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग किया, जो प्रकाश का उपयोग करके मस्तिष्क सर्किट के न्यूरोमॉड्यूलेशन की अनुमति देता है। उत्तेजक ऑप्सिन ओसीएचईएफ को एलए में प्रीसिनेप्टिक एमजीएन टर्मिनलों पर एमजीएन में ओसीएचईएफ युक्त एएवी को शामिल करके व्यक्त किया गया था। ऑप्टिकल फाइबर को तब एलए में प्रत्यारोपित किया गया था और 473 एनएम लेजर प्रकाश को लिमिटेड और रिवर्स कोकीन प्रेरित प्लास्टिसिटी को प्रेरित करने के लिए 15 मिनट के लिए 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर स्पंदित किया गया था। यह हेरफेर नशीली दवाओं की मांग करने वाले कार्यों को प्रेरित करने के लिए कोकीन से जुड़े संकेतों की क्षमता में लंबे समय तक चलने वाली कमी पैदा करता है।
Introduction
मादक द्रव्यों का सेवन अमेरिका और दुनिया भर में एक बहुत ही गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है। दशकों के गहन शोध के बावजूद, बहुत कम प्रभावी चिकित्सीय विकल्प हैं 1,2. उपचार के लिए एक बड़ा झटका यह तथ्य है कि पुरानी दवा का उपयोग पर्यावरणीय संकेतों और दवा के बीच दीर्घकालिक सहयोगी यादें उत्पन्न करता है। दवा से संबंधित संकेतों के पुन: संपर्क में आने से शारीरिक और व्यवहारिक प्रतिक्रियाएं होती हैं जो निरंतर दवा के उपयोग और रिलैप्स को प्रेरित करतीहैं। एक नई चिकित्सीय रणनीति स्मृति-आधारित उपचारों को लागू करना है जिसका उद्देश्य दवा-क्यू संघों को विनियमित करने में शामिल सर्किट में हेरफेर करना है। हाल ही में, यह देखा गया कि पार्श्व एमिग्डाला (एलए) में सिनैप्स, विशेष रूप से थैलेमस के मेडियल जेनिकुलेट न्यूक्लियस (एमजीएन) से उत्पन्न होते हैं, बार-बार क्यू-जुड़े कोकीन स्व-प्रशासन द्वारा मजबूत होते हैं, और यह प्रवर्धन कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार 4,5 का समर्थन कर सकता है। इसलिए, यह प्रस्तावित किया गया था कि एमजीएन-एलए सिनैप्स पर प्लास्टिसिटी को उलटकर क्यू-प्रेरित बहाली को क्षीण किया जा सकता है।
एक विशिष्ट मस्तिष्क सर्किट की सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को ठीक से लक्षित करने की क्षमता क्षेत्र के लिए एक बड़ी चुनौती रही है। पारंपरिक औषधीय उपकरणों को रिलैप्स व्यवहार को कम करने में कुछ सफलता मिली है, लेकिन व्यक्तिगत सिनैप्स में हेरफेर करने में असमर्थता से सीमित हैं। हालांकि, विवो ऑप्टोजेनेटिक्स के हालिया विकास ने इन सीमाओं को दूर करने और अस्थायी और स्थानिक परिशुद्धता 6,7,8 के साथ तंत्रिका मार्गोंको नियंत्रित करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान किए हैं। एक विशिष्ट मस्तिष्क सर्किट में प्रकाश-संवेदनशील ऑप्सिन व्यक्त करके, लेजर प्रकाश का उपयोग सर्किट को सक्रिय या बाधित करने के लिए किया जा सकता है। आवृत्ति-निर्भर ऑप्टिकल उत्तेजना का उपयोग विशेष रूप से व्यवहार करने वाले जानवर में सर्किट की सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है।
यह पांडुलिपि विवो ऑप्टोजेनेटिक्स में उपयोग करके व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक एमजीएन-एलए सर्किट में हेरफेर करने के लिए ली गई प्रक्रिया को रेखांकित करती है। सबसे पहले, उत्तेजक ऑप्सिन ओसीएचईईएफ को एमजीएन में व्यक्त किया गया था और ऑप्टिकल फाइबर को एलए में द्विपक्षीय रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। जानवरों को तब क्यू-निर्भर फैशन में कोकीन को स्व-प्रशासित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था, जो एमजीएन-एलए मार्ग को शक्तिशाली बनाता है। इसके बाद, 473 एनएम लेजर लाइट के साथ निरंतर, कम आवृत्ति उत्तेजना का उपयोग सर्किट-विशिष्ट लिमिटेड का उत्पादन करने के लिए किया गया था। कोकीन के उपयोग से प्रेरित प्लास्टिसिटी को उलटने से उन कार्यों को ट्रिगर करने के लिए संकेतों की क्षमता में दीर्घकालिक कमी उत्पन्न हुई जो दवा की मांग व्यवहार से जुड़े हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि ऊपर वर्णित है, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो उचित प्रयोगात्मक परिणामों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रोटोकॉल केवल उन जानवरों में प्रभावी होगा जो कोकीन स्व-प्रशासन को ठीक से प्राप्त करते …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक यूएसपीएचएस अनुदान K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR), और पेंसिल्वेनिया स्वास्थ्य विभाग से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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