De her beskrevne metoder skitserer en procedure, der anvendes til optogenetisk omvendt kokaininduceret plasticitet i et adfærdsrelevant kredsløb hos rotter. Vedvarende lavfrekvent optisk stimulering af thalamo-amygdala synapser inducerer langvarig depression (LTD). In vivo optogetisk induceret LTD hos kokainerfarne rotter resulterede i den efterfølgende svækkelse af cue-motiveret stofsøgning.
Denne protokol demonstrerer de trin, der er nødvendige for at bruge optogenetiske værktøjer til at vende kokaininduceret plasticitet ved thalamo-amygdala-kredsløb for at reducere efterfølgende kokainsøgende adfærd hos rotten. I vores forskning havde vi fundet ud af, at når rotter selv administrerer intravenøs kokain parret med et audiovisuelt signal, bliver synapser dannet ved input fra thalamusens mediale genikulatkerne (MGN) på de vigtigste neuroner i lateral amygdala (LA) stærkere, efterhånden som cue-kokainforeningen læres. Vi antog, at reversering af den kokaininducerede plasticitet ved disse synapser ville reducere cue-motiveret kokainsøgende adfærd. For at opnå denne type neuromodulation in vivo ønskede vi at fremkalde synaptisk langvarig depression (LTD), hvilket reducerer styrken af MGN-LA-synapser. Til dette formål brugte vi optogenetik, som tillader neuromodulering af hjernekredsløb ved hjælp af lys. Den excitatoriske opsin oChiEF blev udtrykt på præsynaptiske MGN-terminaler i LA ved infusion af en AAV indeholdende oChiEF i MGN. Optiske fibre blev derefter implanteret i LA, og 473 nm laserlys blev pulseret med en frekvens på 1 Hz i 15 minutter for at inducere LTD og omvendt kokaininduceret plasticitet. Denne manipulation giver en langvarig reduktion i evnen hos signaler forbundet med kokain til at fremkalde narkotikasøgningshandlinger.
Stofmisbrug er et meget alvorligt folkesundhedsproblem i USA og over hele verden. På trods af årtiers intens forskning er der meget få effektive terapeutiske muligheder 1,2. Et stort tilbageslag for behandling er, at kronisk stofbrug genererer langsigtede associative minder mellem miljømæssige signaler og selve stoffet. Geneksponering for narkotikarelaterede signaler driver fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, der motiverer fortsat stofbrug og tilbagefald3. En ny terapeutisk strategi er at vedtage hukommelsesbaserede behandlinger, der sigter mod at manipulere de kredsløb, der er involveret i regulering af lægemiddel-cue foreninger. For nylig blev det observeret, at synapser i lateral amygdala (LA), specifikt dem, der stammer fra thalamus mediale genikulatkerne (MGN), styrkes ved gentagen cue-associeret kokain-selvadministration, og at denne potensering kan understøtte kokainsøgende adfærd 4,5. Derfor blev det foreslået, at cue-induceret genindsættelse kunne dæmpes ved at vende plasticitet ved MGN-LA synapser.
Evnen til præcist at målrette den synaptiske plasticitet af et specifikt hjernekredsløb har været en stor udfordring for feltet. Traditionelle farmakologiske værktøjer har haft en vis succes med at reducere tilbagefaldsadfærd, men er begrænset af manglende evne til at manipulere individuelle synapser. Den seneste udvikling af in vivo optogenetik har imidlertid givet de nødvendige værktøjer til at overvinde disse begrænsninger og kontrollere neurale veje med tidsmæssig og rumlig præcision 6,7,8. Ved at udtrykke lysfølsomme opsiner i et specifikt hjernekredsløb kan laserlys derefter bruges til at aktivere eller hæmme kredsløbet. Frekvensafhængig optisk stimulering kan bruges til specifikt at manipulere kredsløbets synaptiske plasticitet i et dyr, der opfører sig.
Dette manuskript skitserer den procedure, der er taget for at manipulere det adfærdsmæssigt relevante MGN-LA-kredsløb ved hjælp af in vivo optogenetik. For det første blev excitatorisk opsin oChIEF udtrykt i MGN, og optiske fibre blev bilateralt implanteret i LA. Dyr blev derefter trænet til selv at administrere kokain på en cue-afhængig måde, hvilket forstærker MGN-LA-vejen. Dernæst blev vedvarende, lavfrekvent stimulering med 473 nm laserlys brugt til at producere kredsløbsspecifik LTD. At vende plasticiteten induceret af kokainbrug genererede en langvarig reduktion i signalernes evne til at udløse handlinger, der er forbundet med stofsøgende adfærd.
Som beskrevet ovenfor er der flere kritiske trin, der er vigtige for at opnå de rette eksperimentelle resultater. Protokollen vil sandsynligvis kun være effektiv i dyr, der korrekt erhverver kokain selvadministration, og til dato er den kun blevet testet ved hjælp af de parametre, der er skitseret ovenfor. Det er muligt, at kokaindosis, forstærkningsplan og cue-parametre kan ændres med sandsynlig lille effekt på adfærdsmæssige resultater, med den undtagelse, at en andenordens forstærkningsplan kan føre til amyg…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra USPHS-tilskud K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) og Pennsylvania Department of Health.
0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
Betadine | Butler Schein | 38250 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
Heparin | Henry Schein | 55737 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Xylazine | Butler Schein | 33198 |