השיטות המתוארות כאן מתארות הליך המשמש להיפוך אופטוגנטי של פלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגל רלוונטי התנהגותית בחולדות. גירוי אופטי מתמשך בתדר נמוך של סינפסות תלמו-אמיגדלה גורם לדיכאון ארוך טווח (LTD). In vivo המושרה אופטיגנטית LTD בחולדות שחוו קוקאין הביאה לאחר מכן להחלשה של חיפוש סמים המונע על ידי רמזים.
פרוטוקול זה מדגים את הצעדים הדרושים לשימוש בכלים אופטוגנטיים כדי להפוך את הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגלי תלמו-אמיגדלה כדי להפחית התנהגויות חיפוש קוקאין עוקבות בחולדה. במחקר שלנו, מצאנו שכאשר חולדות מנהלות בעצמן קוקאין תוך ורידי בשילוב עם רמז אורקולי, סינפסות הנוצרות בקלט מגרעין הגניקולאט המדיאלי של התלמוס (MGN) אל תאי העצב העיקריים של האמיגדלה הצידית (LA) מתחזקות ככל שנלמד הקשר בין רמז לקוקאין. שיערנו כי היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין בסינפסות אלה יפחית התנהגות המונעת על ידי קוקאין המונעת על ידי רמזים. על מנת להשיג סוג זה של נוירומודולציה in vivo, רצינו לגרום לדיכאון סינפטי לטווח ארוך (LTD), אשר מקטין את כוחן של סינפסות MGN-LA. לשם כך השתמשנו באופטוגנטיקה, המאפשרת נוירומודולציה של מעגלים מוחיים באמצעות אור. אופסין oChiEF מעורר בא לידי ביטוי על מסופי MGN presynaptic בלוס אנג’לס על ידי החדרת AAV המכיל oChiEF לתוך MGN. סיבים אופטיים הושתלו אז בלוס אנג’לס ואור לייזר 473 ננומטר פועם בתדר של 1 הרץ למשך 15 דקות כדי לגרום לפלסטיות המושרה על ידי קוקאין ולהפוך אותו. מניפולציה זו מייצרת הפחתה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים הקשורים לקוקאין לגרום לפעולות חיפוש סמים.
שימוש בסמים הוא נושא רציני מאוד לבריאות הציבור בארה”ב וברחבי העולם. למרות עשרות שנים של מחקר אינטנסיבי, יש מעט מאוד אפשרויות טיפוליות יעילות 1,2. מכשול עיקרי בטיפול הוא העובדה ששימוש כרוני בסמים יוצר זיכרונות אסוציאטיביים ארוכי טווח בין רמזים סביבתיים לבין התרופה עצמה. חשיפה חוזרת לרמזים הקשורים לסמים מניעה תגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות המניעות את המשך השימוש בסמים והישנות3. אסטרטגיה טיפולית חדשנית היא ליישם טיפולים מבוססי זיכרון שמטרתם לתמרן את המעגלים המעורבים בוויסות אסוציאציות של רמזי סמים. לאחרונה, נצפה כי סינפסות באמיגדלה הצידית (LA), במיוחד אלה הנובעות מגרעין הגניקולאט המדיאלי (MGN) של התלמוס, מחוזקות על ידי מתן עצמי חוזר ונשנה של קוקאין הקשור לרמזים, וכי הגברה זו יכולה לתמוך בהתנהגות המחפשת קוקאין 4,5. לכן, הוצע כי ניתן להחליש את ההחזרה הנגרמת על ידי רמזים על ידי היפוך הפלסטיות בסינפסות MGN-LA.
היכולת לכוון במדויק לפלסטיות הסינפטית של מעגל מוחי מסוים היוותה אתגר גדול לתחום. כלים פרמקולוגיים מסורתיים נחלו הצלחה מסוימת בהפחתת התנהגויות הישנות, אך הם מוגבלים על ידי חוסר היכולת לתפעל סינפסות בודדות. עם זאת, הפיתוח האחרון של אופטוגנטיקה in vivo סיפק את הכלים הדרושים כדי להתגבר על מגבלות אלה ולשלוט במסלולים עצביים בדיוק זמני ומרחבי 6,7,8. על ידי ביטוי אופסינים רגישים לאור במעגל מוחי מסוים, אור לייזר יכול לשמש כדי להפעיל או לעכב את המעגל. ניתן להשתמש בגירוי אופטי תלוי תדר כדי לתפעל באופן ספציפי את הפלסטיות הסינפטית של המעגל בחיה מתנהגת.
כתב יד זה מתאר את ההליך שננקט כדי לתפעל את מעגל MGN-LA הרלוונטי מבחינה התנהגותית באמצעות אופטוגנטיקה in vivo . ראשית, האופסין המעורר oChIEF בא לידי ביטוי ב-MGN וסיבים אופטיים הושתלו באופן דו-צדדי בלוס אנג’לס. בעלי חיים אומנו אז לתת קוקאין באופן עצמאי באופן תלוי רמז, אשר מחזק את מסלול MGN-LA. לאחר מכן, גירוי מתמשך בתדר נמוך עם אור לייזר 473 ננומטר שימש לייצור LTD ספציפי למעגל. היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי שימוש בקוקאין יצר ירידה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים להפעיל פעולות הקשורות להתנהגות חיפוש סמים.
כפי שתואר לעיל, ישנם מספר שלבים קריטיים החשובים להשגת תוצאות הניסוי הנכונות. סביר להניח שהפרוטוקול יהיה יעיל רק בבעלי חיים שרוכשים כראוי קוקאין בניהול עצמי, ועד כה הוא נבדק רק באמצעות הפרמטרים שפורטו לעיל. ייתכן שניתן לשנות את מינון הקוקאין, לוח הזמנים של החיזוק ופרמטרים של רמזים עם השפעה …
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להכיר בתמיכה ממענקי USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) ומשרד הבריאות של פנסילבניה.
0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
Betadine | Butler Schein | 38250 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
Heparin | Henry Schein | 55737 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Xylazine | Butler Schein | 33198 |