Det gennemblødte perleassay involverer målrettet levering af testreagens på ethvert udviklingstidspunkt for at studere reguleringen af celledifferentiering og morfogenese. En detaljeret protokol, der gælder for enhver forsøgsdyremodel, til fremstilling af tre forskellige typer gennemblødte perler og implantering af disse i et kyllingembryos interdigit præsenteres.
En lang række genetiske programmer aktiveres under embryonal udvikling, der orkestrerer celledifferentiering for at generere en forbløffende mangfoldighed af somatiske celler, væv og organer. Den præcise aktivering af disse genetiske programmer reguleres af morfogener, diffusible molekyler, der styrer celleskæbne ved forskellige tærskler. At forstå, hvordan genetisk aktivering koordinerer morfogenese, kræver undersøgelse af lokale interaktioner udløst af morfogener under udvikling. Anvendelsen af perler gennemblødt i proteiner eller lægemidler implanteret i forskellige områder af embryoet gør det muligt at studere specifikke molekylers rolle i etableringen af cifre og andre udviklingsprocesser. Denne eksperimentelle teknik giver information om kontrol af celleinduktion, celleskæbne og mønsterdannelse. Således er dette gennemblødte perleassay et ekstremt kraftfuldt og værdifuldt eksperimentelt værktøj, der kan anvendes til andre embryonale modeller.
Gennembrud i de molekylære mekanismer, der styrer genekspression under embryonal udvikling, har gjort det muligt for os at forstå, hvordan celleskæbne bestemmes. Forpligtelse til forskellige celleafstamninger opstår, når celler begynder den molekylære ekspression af transkriptionsfaktorer1. Dette ekspressionsmønster er stærkt koordineret i rum og tid og styrer derved formgivningen, placeringen og mønstret af celler, væv og organer 1,2,3,4,5. Embryonal induktion er den proces, hvorved celler er forpligtet til specifikke slægter ved at etablere hierarkier, der begrænser cellernes potentiale, som endda inkluderer generering af den grundlæggende kropsplan, som det sker medSpemann-organisatoren 6,7. Blastopore dorsal læbe inducerer en anden embryonal akse i et værtsembryo 8,9. I dag er det ved hjælp af podning og andre klassiske eksperimenter kombineret med molekylære tilgange kendt, at forskellige transkriptionsfaktorer og vækstfaktorer fungerer til at lede embryonal induktion iSpemann-arrangøren 10. Eksperimentel manipulation er således et vigtigt redskab til at forstå celledifferentiering, morfogenese og mønsterprocesser under embryogenese.
Interessant nok bruges bærere i embryonale systemer, hvor vævstransplantation er vanskelig, eller når induktorerne allerede er velkendte, til at levere molekyler (f.eks. Proteiner, kemikalier, toksiner osv.) for at regulere celledifferentiering, morfogenese og endda mønster. Et sådant bærersystem involverer implantering af perler gennemblødt i et specifikt molekyle i enhver eksperimentel modelorganisme på ethvert udviklingstidspunkt for at bestemme virkningen af det nævnte reagens eller styre differentieringen af den nævnte model. For eksempel ved at implantere retinsyre (RA)-gennemblødte perler i kyllingevingebenknoppen, Cheryl Tickle et al. (1985) demonstrerede, at RA inducerer ekspressionen af sonisk pindsvin i zonen af polariserende aktivitet (ZPA) 11,12. Den samme eksperimentelle strategi blev brugt til at opdage, at RA styrer asymmetrien af somitter og celledød i lemmernes knopp under cifferudvikling og i andre embryonale lemmerregioner 13,14,15. Andre faktorer, hovedsagelig proteiner (f.eks. fibroblastvækstfaktorer [FGF], transformerende vækstfaktor-beta [TGF-ß]) er blevet brugt til at inducere lemmer i tidlige embryoners flanker og nye cifre i den interdigitale region, henholdsvis 16,17,18,19,20,21 . Disse eksperimenter beviser kraften og nytten af denne teknik til bestemmelse af stadiet af engagement eller kompetence af væv eller grupper af celler udsat for molekylerne.
I denne protokol tjente kyllingelemmet på tidspunktet for cifferdannelse som den eksperimentelle model til at præsentere trin for trin, hvordan man forbereder og implanterer de gennemblødte perler. Dette eksperimentelle værktøj er imidlertid ikke begrænset til denne applikation, men kan udnyttes i enhver eksperimentel dyremodel og ethvert tidspunkt in vitro og in vivo til at studere induktion, differentiering, celledød og mønster.
Den største fordel ved det eksperimentelle værktøj, der er beskrevet i denne protokol, er at være i stand til at kontrollere tid og sted for eksponeringen for perler gennemblødt i et givet eksperimentelt molekyle. Kombinationen af den korrekte positionering med præcis udviklingstid giver enorme muligheder for at studere celledifferentieringsprocesser. Udførelse af disse eksperimenter i udifferentieret væv gør det muligt at undersøge de første afgørende begivenheder i cellulær afstamning. For eksempel resulte…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [tilskudsnumre IN211117 og IN213314] og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [tilskudsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tildelt JC-M. JC M-L modtog et postdoc-stipendium fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Forfatterne sætter pris på hjælp fra Lic. Lucia Brito fra Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM i udarbejdelsen af referencer til dette manuskript.
Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
Petri dish | Nest | 705001 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
Tape | NA | NA | |
Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |