Summary

Analyse af celledifferentiering, morfogenese og mønster under kyllingembrogenese ved hjælp af det gennemblødte perleassay

Published: January 12, 2022
doi:

Summary

Det gennemblødte perleassay involverer målrettet levering af testreagens på ethvert udviklingstidspunkt for at studere reguleringen af celledifferentiering og morfogenese. En detaljeret protokol, der gælder for enhver forsøgsdyremodel, til fremstilling af tre forskellige typer gennemblødte perler og implantering af disse i et kyllingembryos interdigit præsenteres.

Abstract

En lang række genetiske programmer aktiveres under embryonal udvikling, der orkestrerer celledifferentiering for at generere en forbløffende mangfoldighed af somatiske celler, væv og organer. Den præcise aktivering af disse genetiske programmer reguleres af morfogener, diffusible molekyler, der styrer celleskæbne ved forskellige tærskler. At forstå, hvordan genetisk aktivering koordinerer morfogenese, kræver undersøgelse af lokale interaktioner udløst af morfogener under udvikling. Anvendelsen af perler gennemblødt i proteiner eller lægemidler implanteret i forskellige områder af embryoet gør det muligt at studere specifikke molekylers rolle i etableringen af cifre og andre udviklingsprocesser. Denne eksperimentelle teknik giver information om kontrol af celleinduktion, celleskæbne og mønsterdannelse. Således er dette gennemblødte perleassay et ekstremt kraftfuldt og værdifuldt eksperimentelt værktøj, der kan anvendes til andre embryonale modeller.

Introduction

Gennembrud i de molekylære mekanismer, der styrer genekspression under embryonal udvikling, har gjort det muligt for os at forstå, hvordan celleskæbne bestemmes. Forpligtelse til forskellige celleafstamninger opstår, når celler begynder den molekylære ekspression af transkriptionsfaktorer1. Dette ekspressionsmønster er stærkt koordineret i rum og tid og styrer derved formgivningen, placeringen og mønstret af celler, væv og organer 1,2,3,4,5. Embryonal induktion er den proces, hvorved celler er forpligtet til specifikke slægter ved at etablere hierarkier, der begrænser cellernes potentiale, som endda inkluderer generering af den grundlæggende kropsplan, som det sker medSpemann-organisatoren 6,7. Blastopore dorsal læbe inducerer en anden embryonal akse i et værtsembryo 8,9. I dag er det ved hjælp af podning og andre klassiske eksperimenter kombineret med molekylære tilgange kendt, at forskellige transkriptionsfaktorer og vækstfaktorer fungerer til at lede embryonal induktion iSpemann-arrangøren 10. Eksperimentel manipulation er således et vigtigt redskab til at forstå celledifferentiering, morfogenese og mønsterprocesser under embryogenese.

Interessant nok bruges bærere i embryonale systemer, hvor vævstransplantation er vanskelig, eller når induktorerne allerede er velkendte, til at levere molekyler (f.eks. Proteiner, kemikalier, toksiner osv.) for at regulere celledifferentiering, morfogenese og endda mønster. Et sådant bærersystem involverer implantering af perler gennemblødt i et specifikt molekyle i enhver eksperimentel modelorganisme på ethvert udviklingstidspunkt for at bestemme virkningen af det nævnte reagens eller styre differentieringen af den nævnte model. For eksempel ved at implantere retinsyre (RA)-gennemblødte perler i kyllingevingebenknoppen, Cheryl Tickle et al. (1985) demonstrerede, at RA inducerer ekspressionen af sonisk pindsvin i zonen af polariserende aktivitet (ZPA) 11,12. Den samme eksperimentelle strategi blev brugt til at opdage, at RA styrer asymmetrien af somitter og celledød i lemmernes knopp under cifferudvikling og i andre embryonale lemmerregioner 13,14,15. Andre faktorer, hovedsagelig proteiner (f.eks. fibroblastvækstfaktorer [FGF], transformerende vækstfaktor-beta [TGF-ß]) er blevet brugt til at inducere lemmer i tidlige embryoners flanker og nye cifre i den interdigitale region, henholdsvis 16,17,18,19,20,21 . Disse eksperimenter beviser kraften og nytten af denne teknik til bestemmelse af stadiet af engagement eller kompetence af væv eller grupper af celler udsat for molekylerne.

I denne protokol tjente kyllingelemmet på tidspunktet for cifferdannelse som den eksperimentelle model til at præsentere trin for trin, hvordan man forbereder og implanterer de gennemblødte perler. Dette eksperimentelle værktøj er imidlertid ikke begrænset til denne applikation, men kan udnyttes i enhver eksperimentel dyremodel og ethvert tidspunkt in vitro og in vivo til at studere induktion, differentiering, celledød og mønster.

Protocol

Denne forskning blev gennemgået og godkendt af Institutional Review Board for pleje og brug af forsøgsdyr fra Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). 1. Æginkubation og embryo iscenesættelse BEMÆRK: Befrugtede høneæg kan fås fra lokale gårde. Befrugtede hvide leghorn kyllingæg er mest almindeligt anvendt. Opbevar de friskgødede kyllingæg ved 15 °C i op til 1 uge før…

Representative Results

Brug af gennemblødte perler til at evaluere celleadfærd i det embryonale kyllingelemFor at sikre effektiviteten af dette assay skal adlen placeres konsekvent og præcist på det rigtige sted; i dette tilfælde den distale-most af den tredje interdigit under den apikale ektodermale højderyg AER (figur 1A). Denne positionering gør det muligt for det pågældende molekyle at sprede sig ligeligt gennem det interdigitale væv. Desuden indeholder zonen under AER udifferent…

Discussion

Den største fordel ved det eksperimentelle værktøj, der er beskrevet i denne protokol, er at være i stand til at kontrollere tid og sted for eksponeringen for perler gennemblødt i et givet eksperimentelt molekyle. Kombinationen af den korrekte positionering med præcis udviklingstid giver enorme muligheder for at studere celledifferentieringsprocesser. Udførelse af disse eksperimenter i udifferentieret væv gør det muligt at undersøge de første afgørende begivenheder i cellulær afstamning. For eksempel resulte…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [tilskudsnumre IN211117 og IN213314] og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [tilskudsnummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tildelt JC-M. JC M-L modtog et postdoc-stipendium fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Forfatterne sætter pris på hjælp fra Lic. Lucia Brito fra Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM i udarbejdelsen af referencer til dette manuskript.

Materials

Affi-Gel Blue Gel beads Bio-Rad 153-7302
AG1-X2 beads Bio-Rad 1400123
Egg incubator Incumatic de Mexico Incumatic 1000
Fine surgical forceps Fine Science Tools 9115-10
Heparine Sepharose beads Abcam ab193268
Petri dish Nest 705001
Stereomicroscope Zeiss Stemi DV4
Tape NA NA
Tungsten needle GoodFellow E74-15096/01

References

  1. Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
  2. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  3. Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
  4. Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
  5. Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
  6. Gurdon, J. B. Embryonic induction–molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
  7. Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
  8. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
  9. Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
  10. Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
  11. Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
  12. Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Biologie du développement. 109 (1), 82-95 (1985).
  13. Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
  14. Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
  15. Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Biologie du développement. 302 (1), 267-280 (2007).
  16. Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
  17. Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
  18. Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
  19. Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
  20. Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Biologie du développement. 200 (1), 35-45 (1998).
  21. Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Biologie du développement. 321 (2), 343-356 (2008).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  23. Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
  24. Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
  25. Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Biologie du développement. 257 (2), 292-301 (2003).
check_url/fr/63187?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Marín-Llera, J. C., Chimal-Monroy, J. Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay. J. Vis. Exp. (179), e63187, doi:10.3791/63187 (2022).

View Video