Analyse av celledifferensiering, morfogenese og mønster under kyllingembryogenese ved hjelp av den gjennomvåte perleanalysen

Summary

Den gjennomvåte perleanalysen innebærer målrettet levering av testreagens på ethvert utviklingsmessig tidspunkt for å studere reguleringen av celledifferensiering og morfogenese. En detaljert protokoll, som gjelder for enhver eksperimentell dyremodell, for å forberede tre forskjellige typer gjennomvåt perler og implantere disse i mellombarn av et kyllingembryo, presenteres.

Abstract

En rekke genetiske programmer aktiveres under embryonal utvikling som orkestrerer celledifferensiering for å generere et forbløffende mangfold av somatiske celler, vev og organer. Den nøyaktige aktiveringen av disse genetiske programmene er regulert av morfogene, diffusible molekyler som styrer celle skjebne på forskjellige terskler. Å forstå hvordan genetisk aktivering koordinerer morfogenese krever studiet av lokale interaksjoner utløst av morfogenes under utvikling. Bruken av perler gjennomvåt i proteiner eller legemidler implantert i forskjellige områder av embryoet gjør det mulig å studere rollen som spesifikke molekyler i etableringen av sifre og andre utviklingsprosesser. Denne eksperimentelle teknikken gir informasjon om kontroll av celleinduksjon, celle skjebne og mønsterdannelse. Dermed er denne gjennomvåte perleanalysen et ekstremt kraftig og verdifullt eksperimentelt verktøy som gjelder for andre embryonale modeller.

Introduction

Gjennombrudd i molekylære mekanismer som kontrollerer genuttrykk under embryonal utvikling har gjort det mulig for oss å forstå hvordan celle skjebne bestemmes. Forpliktelse til forskjellige celleavledninger oppstår når cellene begynner molekylært uttrykk for transkripsjonsfaktorer¹. Dette uttrykksmønsteret er svært koordinert i rom og tid og styrer dermed forming, posisjonering og mønster av celler, vev og organer 1,2,3,4,5. Embryonal induksjon er prosessen der celler er forpliktet til spesifikke avstamninger ved å etablere hierarkier som begrenser cellenes potensial, som til og med inkluderer genereringen av den grunnleggende kroppsplanen som følger med^{Spemann-arrangøren 6,7}. Blastopore dorsal leppe induserer en annen embryonal akse i en vert embryo ^8,9. I dag, ved hjelp av podning og andre klassiske eksperimenter kombinert med molekylære tilnærminger, er det kjent at forskjellige transkripsjonsfaktorer og vekstfaktorer fungerer for å lede embryonal induksjon i^{Spemann-arrangøren 10}. Dermed er eksperimentell manipulasjon et viktig verktøy for å forstå celledifferensiering, morfogenese og mønsterprosesser under embryogenese.

Interessant, i embryonale systemer der vevstransplantasjon er vanskelig eller når induserne allerede er godt kjent, brukes bærere til å levere molekyler (f.eks. proteiner, kjemikalier, giftstoffer, etc.) for å regulere celledifferensiering, morfogenese og til og med mønster. Et slikt bærersystem innebærer implantering av perler gjennomvåt i et bestemt molekyl i enhver eksperimentell modellorganisme på et hvilket som helst utviklingstidspunkt for å bestemme effekten av nevnte reagens eller lede differensiering av nevnte modell. For eksempel, ved å implantere retinoinsyre (RA)-gjennomvåte perler i kyllingfløyens lemknopp, viste Cheryl Tickle et al. (1985) at RA induserer uttrykket av sonisk pinnsvin i sonen av polariserende aktivitet (ZPA) ^11,12. Den samme eksperimentelle strategien ble brukt til å oppdage at RA kontrollerer asymmetrien av somitter og celledød i lemknoppen under sifferutvikling og i andre embryonale lemregioner 13,14,15. Andre faktorer, hovedsakelig proteiner (f.eks. fibroblast vekstfaktorer [FGF], transformering av vekstfaktor-beta [TGF-ß]) har blitt brukt til å indusere lemmer i tidlige embryoers flanker og nye sifre i den interdigitale regionen, henholdsvis 16,17,18,19,20,21 . Disse eksperimentene viser kraften og nytten av denne teknikken for å bestemme scenen for engasjement eller kompetanse av vev eller grupper av celler utsatt for molekylene.

I denne protokollen fungerte kyllinglemmen på scenen av sifferdannelse som eksperimentell modell for å presentere trinnvis hvordan man forbereder og implanterer de gjennomvåte perlene. Dette eksperimentelle verktøyet er imidlertid ikke begrenset til denne applikasjonen, men kan utnyttes i enhver eksperimentell dyremodell og ethvert tidspunkt in vitro og in vivo for å studere induksjon, differensiering, celledød og mønster.

Protocol

Denne forskningen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board for care and use of Laboratory Animals of the Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico). 1. Egginkubasjon og embryooppsamling MERK: Befruktede høneegg kan fås fra lokale gårder. Befruktede hvite leghorn kyllingegg er mest brukt. Oppbevar de nybefruktede kyllingeggene ved 15 °C i opptil 1 uke før inkuba…

Representative Results

Bruke gjennomvåt perler for å evaluere celleadferd i embryonal kylling lemFor å sikre effekten av denne analysen, må perlen plasseres konsekvent og presist på riktig sted; i dette tilfellet er det distale mest av det tredje interdigit under den apikale ektodermale åsen AER (figur 1A). Denne posisjoneringen tillater det aktuelle molekylet å spre seg likt gjennom det interdigitale vevet. Videre inneholder sonen under AER ubeskyttede celler som er lett lydhøre for b…

Discussion

Den største fordelen med det eksperimentelle verktøyet som er beskrevet i denne protokollen, er å kunne kontrollere tiden og plasseringen av eksponeringen for perler gjennomvåt i et gitt eksperimentelt molekyl. Å kombinere riktig posisjonering med presis utviklingstid gir enorme muligheter til å studere celledifferensieringsprosesser. Å utføre disse eksperimentene i undifferentiated vev gjør det mulig å undersøke de første viktige hendelsene i cellulær avstamning. For eksempel, å plassere en TGFß-gjennomv?…

Materials

Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest	705001
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01